Ein Zusammenhang zwischen Agrin-Signalisierung und Cav3.2 an der neuromuskulären Verbindung bei spinaler Muskelatrophie

May 01, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 18960 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Ein Mangel an SMN-Protein führt zur spinalen Muskelatrophie (SMA) der Motoneuronerkrankung. SMN-basierte Therapien verbessern die motorischen Symptome des Patienten in unterschiedlichem Maße. Ein frühes Kennzeichen von SMA ist die Störung der neuromuskulären Verbindung (NMJ), einer Synapse zwischen einem Motoneuron und einer Muskelzelle. Die NMJ-Bildung hängt von der Clusterbildung des Acetylcholinrezeptors (AChR) ab, die durch den Signalweg Agrin und seine Co-Rezeptoren Lipoproteinrezeptor-verwandtes Protein 4 (LRP4) und Transmembrane Muscle-Specific Kinase (MuSK) ausgelöst wird. Wir haben zuvor gezeigt, dass Flunarizin die NMJs bei SMA-Modellmäusen verbessert, die Mechanismen sind jedoch noch unklar. Wir zeigen hier, dass Flunarizin die AChR-Clusterbildung in C2C12-Myotubes auf zellautonome, dosis- und agrinabhängige Weise fördert. Dies ist mit einem Anstieg der Proteinspiegel von LRP4, Integrin-Beta-1 und Alpha-Dystroglycan, drei Agrin-Corezeptoren, verbunden. Darüber hinaus verstärkt Flunarizin die MuSK-Wechselwirkung mit Integrin-Beta-1 und Phosphotyrosinen. Darüber hinaus wirkt das Medikament muskelspezifisch auf die Expression und das Spleißen der Agrn- und Cacna1h-Gene. Wir zeigen, dass das von Cacna1h kodierte Protein Cav3.2 in vitro eng mit dem Agrin-Co-Rezeptor LRP4 assoziiert. In vivo wird es während der Neugeborenenentwicklung in der Nähe von NMJs angereichert und das Medikament verstärkt diese Immunmarkierung in den SMA-Muskeln. Somit moduliert Flunarizin wichtige Akteure des NMJ und identifiziert Cav3.2 als neues Protein, das an der NMJ-Biologie beteiligt ist.

Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist durch die Degeneration spinaler Motoneuronen und Muskelatrophie gekennzeichnet. SMA wird durch Mutationen des Survival Moto Neuron 1 (SMN1)-Gens verursacht, die zu einer Verringerung der SMN-Proteinspiegel führen1,2. Dieses Protein ist ein allgegenwärtig exprimiertes DNA/RNA-bindendes Protein, das an der Regulierung der Genexpression, einschließlich Transkription, Spleißen, RNA-Transport und Translation, beteiligt ist. Die am besten charakterisierte Funktion ist seine Rolle bei der Biogenese der U-reichen kleinen nuklearen Ribonukleoproteine ​​(snRNPs)3. 4,5. Beim Menschen führt das Vorhandensein eines Kopiegens SMN2 zu weniger voll funktionsfähigem Protein aufgrund einer alternativen Spleißung des letzten kodierenden Exons 76. Dementsprechend werden mildere SMA-Phänotypen beobachtet, wenn die Anzahl der Kopien des SMN2-Gens zunimmt7,8. Die zugelassenen SMA-Therapien zielen darauf ab, die SMN-Proteinspiegel zu erhöhen, indem sie entweder die SMN-Gentherapie oder die gezielte Behandlung der SMN2-Prä-mRNA mit einem Antisense-Oligonukleotid (ASO) oder einem kleinen Molekül nutzen. Trotz dieser enormen wissenschaftlichen und klinischen Fortschritte sind einige Patienten nicht in der Lage, diese Medikamente einzunehmen, andere reagieren schlecht darauf und manchmal treten Nebenwirkungen auf9,10,11,12,13. Daher sollte ein besseres Verständnis der der Krankheit zugrunde liegenden Mechanismen zur Entwicklung besserer Therapien mit klinischer Bedeutung beitragen.

Defekte der neuromuskulären Verbindung (NMJ) wurden bei der Pathogenese von SMA vor dem Verlust von Motoneuronen beobachtet, was mit einem „Absterben“-Phänotyp vereinbar ist14,15,16. Tatsächlich werden bei SMA-Modellmäusen eine verzögerte Reifung, eine kleinere Endplattenfläche und eine Endplattendenervierung festgestellt17,18,19. Ein Kennzeichen der NMJs ist die Anhäufung muskulärer Acetylcholinrezeptoren (AChRs) auf der postsynaptischen Muskelmembran, die durch das von den Motoneuronen abgesonderte Agrin vermittelt wird20. Agrin bindet den Rezeptor LRP4 und dann bindet und aktiviert der Agrin-LRP4-Komplex die Transmembran-MuSK und fördert die AChR-Clusterbildung durch Adapter wie Docking-Protein 7 (Dok7)21,22. Darüber hinaus sterben Mäuse, denen das funktionelle Agrn-, Lrp4- oder Musk-Gen fehlt, perinatal.

Das Agrn-Gen produziert mehrere Isoformen in verschiedenen Geweben mithilfe von zwei Promotoren und alternativem Spleißen von Exons, die für Domänen des C-Terminus kodieren, wie z. B. die Y- und Z-Stellen23,24,25. Die alternativen ersten Exons kodieren entweder für die sekretorischen (NtA) oder die transmembranen (Tm) N-Termini, wobei letztere hauptsächlich in Neuronen exprimiert werden, während NtA auch in nicht-neuralen Zellen wie Muskeln exprimiert wird26. Die neuronalen Z+-Agrin-Isoformen bündeln die AChRs im Vergleich zum Muskel-Z-Agrin23 stark. Als Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) binden Agrine auch an Laminin-, Heparin-, α-Dystroglycan- und β1-Integrine27,28. Somit ist Agrin auch an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt: ​​Es erhält das NMJ aufrecht29, fördert die Herzregeneration30, hemmt die Neuritenverlängerung31,32,33, reguliert die Synaptogenese im Zentralnervensystem34 und koordiniert eine Überkreuzung zwischen LRP4/MuSK- und Integrin-β1-Signalwegen Leberkrebs35,36.

Die Rolle des Agrin/LRP4/MuSK/Dok7-Signalwegs bei der SMA-Erkrankung wurde erstmals durch die Beobachtung unterstrichen, dass das Agrin-Z+-Exon in spinalen Motoneuronen von SMA-Modellmäusen37 falsch gespleißt ist, was durch die Koexpression von AAV-9 korrigiert werden kann U7-spezifische Lsm10- und Lsm11-Proteine38. Die Modulation der Agrin-Signalisierung durch Überexpression eines transgenen Z+-Agrins, Injektion eines therapeutischen Agrins oder AAV-Dok7-Verabreichung mildert den Phänotyp von SMA-Mäusen39,40,41. Außerdem reduziert der MuSK-Agonisten-Antikörper die neuromuskulären Defekte bei SMA-Mäusen42. Somit hat die Verbesserung der NMJ-Funktion durch Agrin-Signalisierung therapeutische Auswirkungen auf die Pathogenese bei SMA-Modellmäusen. Dennoch bleibt die Expression der Agrn-Exons außer den Z+-Exons bei SMA-Mäusen und nach Behandlungen weitgehend unerforscht.

Die Bedeutung von NMJs bei der SMA-Erkrankung wurde weiter verdeutlicht, als wir berichteten, dass Flunarizin die Endplattenfläche und Reifung von NMJs vergrößert und den Krankheitsphänotyp bei SMA-Mäusen verbessert, allerdings unabhängig von den Spiegeln der snRNAs und der Agrn Z+-Exons43. Die genaue Wirkungsweise auf das NMJ bleibt unbekannt. Flunarizin wurde zuvor als T-Typ-Kalziumkanalblocker44 verwendet und wurde in einem chemischen Screening als Spleißregulator identifiziert45. Sowohl der Kalziumspiegel als auch der RNA-Metabolismus sind in SMA-Modellen verändert46,47,48,49,50,51. Darüber hinaus mildert die ASO-Behandlung von SMA-Mäusen die Spleißdefekte von U12-abhängigen Introns mehrerer Gene, einschließlich Cacna1h, das für den T-Typ-Kalziumkanal Cav3.247 kodiert.

Wir stellten uns dann eine Wirkung von Flunarizin auf die Expression und das Spleißen der Agrn- und Cacna1h-Gene in der Skelettmuskulatur vor. Um diese Frage zu beantworten, haben wir untersucht, wie Flunarizin die NMJ-Größe bei Kontroll- und SMA-Modellmäusen erhöht. Da die Arzneimittelwirkungen muskelabhängig und SMN-unabhängig sind43, haben wir die Auswirkungen von Flunarizin auf kultivierte C2C12-Myotubes der Maus untersucht. Wir berichten, dass das Medikament in vitro die AChR-Clusterbildung stimuliert, ein frühes Ereignis bei der NMJ-Bildung. Dieser Effekt weist eine ähnliche Konzentrationsabhängigkeit auf wie die Hemmung des Cav3.2-Stroms, was darauf hindeutet, dass eine Kanalblockierung erforderlich ist. Darüber hinaus zeigen wir in vitro und in vivo, dass die Expression und das Spleißen der Agrn- und Cacna1h-Gene durch Flunarizin co-reguliert zu werden scheinen. Wir zeigen auch, dass der Agrin-Co-Rezeptor LRP4 mit Cav3.2 assoziiert, das wir in der Neugeborenenperiode von Mäusen in der Nähe von NMJs finden. Wichtig ist, dass die Cav3.2-Immunmarkierung in SMA-Muskeln durch Flunarizin erhöht wird. Daher schlagen wir Flunarizin-Effekte vor, um Cav3.2 mit der Bildung und Reifung perinataler NMJs in Verbindung zu bringen.

Wir haben zuvor gezeigt, dass Flunarizin postsynaptische NMJs unabhängig von den SMN-Proteinspiegeln in Kontrollmäusen und SMA-Modellmäusen vergrößert. Dies impliziert, dass die Muskeln möglicherweise direkt auf Flunarizin reagieren. Um diese Idee zu testen, haben wir untersucht, ob Flunarizin in vitro die Bildung von AChR-Clustern in kultivierten C2C12-Maus-Myoblasten stimuliert, die zu Myotubes fusioniert sind (Abb. 1A). AChR-Cluster werden mithilfe eines fluoreszierenden α-Bungarotoxins (α-BTX) sichtbar gemacht. Flunarizin (4 μM) erhöhte die Anzahl und Größe der Cluster signifikant um das Drei- bis Vierfache (Abb. 1B, E). Darüber hinaus war die durch Flunarizin induzierte Clusterbildung dosisabhängig (Abb. 1C). Die halbmaximale Konzentration (EC50) betrug 1,3 μM und 4 μM ergaben maximale Auswirkungen auf die Clusterbildung. Wir untersuchten auch Flunarizin auf dem T-Typ-Kalziumkanal Cav3.2 in stabil exprimierenden HEK293-Zellen (Abb. 1D). Elektrophysiologische Aufzeichnungen ergaben, dass für Flunarizin eine ähnliche Abhängigkeit der Arzneimittelkonzentration von der Cav3.2-Kanalaktivität (IC50 = 3,44 µM) festgestellt wird. Bemerkenswert ist, dass der zeitliche Verlauf der Flunarizin-Hemmung zeigt, dass eine maximale Hemmung durch 10 µM Flunarizin nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten erreicht wird (ergänzende Abbildung 7). Daher stimuliert Flunarizin die AChR-Clusterbildung höchstwahrscheinlich durch eine direkte Wirkung auf den Cav3.2-Kanal, was auf eine direkte Rolle von Muskelzellen bei der positiven Wirkung des Arzneimittels bei SMA-Modellmäusen schließen lässt.

Flunarizin fördert die AChR-Clusterbildung in den C2C12-Myotubes der Maus. (A) Schematische Darstellung der C2C12-Muskelzellkulturen und Behandlung. (B) Fluoreszenzbildgebung der AChR-Cluster mit α-Bungarotoxin (α-BTX) auf DMSO- und Flunarizin (FZ)-behandelten Myotubes. (C) Eine Flunarizin-Dosis-Wirkungs-Kurve der AChR-Clusterbildung (3 ≤ n ≤ 5 für jede Konzentration von 100, 250, 500, 1000, 4000 und 10.000 nM, außer 2 für 10 μM). (D) Konzentrations-Reaktionskurve der Wirkung von Flunarizin auf Cav3.2-Kanäle. Für jeden Punkt wurde die mittlere Stromdichte auf die mittlere Stromdichte der Fahrzeuggruppe normiert (7 < n < 24 für jede Konzentration, Fehlerbalken sind SEM). (E) Sowohl die Größe als auch die Anzahl der AChR-Cluster nahmen mit dem Medikament zu. Die Spalten stellen die Anzahl der Cluster für die gleiche Anzahl von Myotubes pro Bedingung dar, die mit ImageJ aus 3 unabhängigen Experimenten analysiert wurden (345 Myotubes pro Bedingung). (F) Expression endogener Proteine ​​in Gesamtproteinextrakten von C2C12-Myoblasten in Proliferationsmedium (PM) und DMSO- und FZ-behandelten Myotubes in Differenzierungsmedium während 7 Tagen (Diff7). Die Zellen wurden nach einer DMSO- und FZ-Behandlung über Nacht geerntet. Die PVDF-Membran wurde mit oder ohne Stripping-Schritt mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet. α-Tubulin dient als Ladungskontrolle. Im Vergleich zur Tubulin-Beladungskontrolle mit dem Arzneimittel wird ein Anstieg der GAPDH-Proteinspiegel um 50 % festgestellt. Unbeschnittene Bilder finden Sie in der ergänzenden Abbildung 3. (G) Die Spalten stellen fache Änderungen der Proteinexpression in FZ-behandelten Myotubes im Vergleich zur DMSO-Behandlung (1 μl/ml) dar. (H) Auswirkungen blockierender Antikörper gegen Agrin (Anti-Agrin), Integrin β1 (Anti-ITGB1) und α-Dystroglycan (α-Dg1) auf die AChR-Clusterbildung in Gegenwart von Flunarizin (FZ) im Vergleich zu negativem Kontroll-IgG. (I) Die Spalten stellen die Anzahl der Cluster (Größe > 5 μm) aus 40 zufällig ausgewählten Feldern jeder Bedingung pro Experiment dar. Fehlerbalken stellen SD aus den Mittelwerten von 3 unabhängigen Experimenten dar. Unter Kontrollbedingungen wird verdünntes DMSO verwendet, da Flunarizin in wässriger Lösung unlöslich ist. Khi-2-Test, *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. Maßstabsbalken, 30 μm.

Um die Flunarizin-Mechanismen zu analysieren, die die AChR-Clusterbildung induzieren, untersuchten wir die Proteinspiegel wichtiger NMJ-Moleküle mit Schwerpunkt auf der AChRα-Untereinheit, Lrp4, MuSK, Dystroglycanen (dg), Ca2+/Calmodulin-abhängiger Proteinkinase II (CaMKII), Integrin β1 und α11 in C2C12 Myotubes (Abb. 1F,G). Es wurde keine Wirkung von Flunarizin (4 μM) auf die Proteinspiegel von AChRα, MuSK und β-Dystroglycan festgestellt, während für die Integrine Lrp4, β1 und α11 bzw. das α-Dystroglycan-Epitop ein Anstieg um 30, 50, 60 und 70 % beobachtet wurde. Wir haben auch untersucht, ob die Überexpression von Dynamin2 (Dyn2) die AChR-Clusterbildung induziert52 und die NMJ-Entwicklung reguliert53. Unter Flunarizin wurde ein Anstieg der Dyn2- und GAPDH-Proteinspiegel gezeigt. Es wurden keine Arzneimittelwirkungen auf die CaMKII-Proteinspiegel oder die Phosphorylierung beobachtet, was eine mögliche Beteiligung von CaMKII ausschließt, das auch die AChR-Expression und -Clusterbildung reguliert54,55. Die Proteingehalte von SMN und Unrip (eine weitere Komponente des SMN-Komplexes) blieben erwartungsgemäß unverändert56. Somit kann Flunarizin die Agrin-Signalübertragung fördern, da Lrp4/MuSK, β1-Integrine und α-Dystroglycan alles Agrin-Rezeptoren sind, die an der NMJ-Biologie beteiligt sind25.

Die einzige Agrinquelle in unseren Experimenten stammt aus C2C12-Myotubes. Wir fragten dann, ob Antikörper, die Agrin, Integrin-β1 oder α-Dystroglycan blockieren, die Flunarizin-induzierte AChR-Clusterbildung beeinflussen. Die Myotubes wurden mit dem Arzneimittel und dem monoklonalen Anti-Agrin-Maus-Antikörper Mab520435 oder dem monoklonalen Anti-Integrin-β1-Maus-Antikörper Mab196557 oder dem monoklonalen Anti-α-Dystroglycan-Maus-Antikörper IIH6C458 oder einem negativen Kontroll-Maus-Antikörper behandelt (Abb. 1H, I). . Unter unseren Bedingungen hemmten die Antikörper Mab5204 und Mab1965 die AChR-Clusterbildung deutlich, nicht jedoch IIH6C4 und Kontrollantikörper. Darüber hinaus ist α-Dystroglykan in allen AChR-Clustern in Flunarizin-behandelten Myotubes lokalisiert (ergänzende Abbildung 4), was eine weitere Rolle bei der Clusterstabilisierung statt bei der Clusterbildung unterstützt. Daher hängt die Flunarizin-induzierte AChR-Clusterbildung in vitro von Agrin und Integrin-β1 ab.

Die bisher präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass Flunarizin die AChR-Clusteraktivität von C2C12-abgeleitetem Agrin verstärkt. Anschließend untersuchten wir, ob das Medikament einen Einfluss auf die Expression des Muskel-Agrn-Gens und seiner gespleißten Isoformen haben könnte. Agrine werden von zwei verschiedenen Transkriptionsstartstellen exprimiert, was zu zwei N-Termini, sekretiertem NtA oder Transmembran-TM führt, gefolgt von einer gemeinsamen Sequenz und den alternativen Y- und Z-Exons, die für die C-terminale Region kodieren, die die Bindungsstellen für Integrin-β1 enthält bzw. LRP428 (Abb. 2A). Mit dem Wissen, dass die Z-Stelle die AChR-Clusterbildung erheblich verstärkt60, war es möglich, dass Flunarizin den Einschluss von Z-Exons fördern könnte. Tatsächlich zeigen wir, dass sie in C2C12-Myotubes weder vorhanden sind noch durch das Medikament induziert werden, was diese Möglichkeit ausschließt (Abb. 2B). Somit fanden wir heraus, dass die Flunarizin-induzierte AChR-Clusterbildung unabhängig vom Z+-Agrin ist.

Auswirkungen von Flunarizin auf die Expression und das Spleißprofil des Agrn-Gens in C2C12-Myotubes und Skelettmuskeln von SMA-Modellmäusen. (A) Schematische Darstellung der Agrin-Struktur, die die alternative erste Exon-Verwendung des löslichen Basallamina-assoziierten Agrins (NtA) oder der membrandurchspannenden Domäne und einer kurzen intrazellulären Region (TM) am N-terminalen Ende und an den Spleißstellen zeigt „Y“ und „Z“ der C-Termini mit schematischer Darstellung der Y- und Z-Exons des Agrn-Gens. (B) Repräsentative Analyse durch RT-PCR auf Agarosegel der Agrn Z-Exons in DMSO- und Flunarizin (FZ)-behandelten C2C12-Myotubes (Diff7). (C–E) Die RT-qPCR-Analyse der Expression der Exons NtA, Tm, ex5-6, ex29-30 und Y des Agrn-Gens wird in C2C12-Myotubes im Vergleich zu Myoblasten im Proliferationsmedium (PM) durchgeführt. Gesamt-RNA wird aus C2C12-Myoblasten hergestellt, die in Proliferationsmedium (PM) oder nach 7 Tagen in Differenzierungsmedium (D7) mit entweder DMSO oder Flunarizin (FZ) für die letzten 16 Stunden gezüchtet wurden. RNA-Spiegel in (C), Expressionsverhältnisse zwischen Exons und ex5-6-RNA-Spiegeln in (D) und Anteil von NtA gegenüber TM in (E) werden berechnet. Ex5-6 ist in allen Agrn-mRNAs enthalten. PM erhielt in C und D einen willkürlichen Wert von 1. (F–N) Eine RT-qPCR-Analyse der Expression verschiedener Exons des Agrn-Gens wird im Soleus (F), Plantaris (G) und Tibialis (H) durchgeführt. von Kontroll- und SMA-Modellmäusen bei P10. Dem Kontrollvehikel wird ein willkürlicher Wert von 1 zugewiesen. Die Anteile der ersten Exons NtA gegenüber Tm werden für Soleus (I), Plantaris (J) und Tibialis (K) berechnet. Expressionsverhältnisse zwischen Exons und ex5-6-Ebenen werden für Soleus (L), Plantaris (M) und Tibialis (N) berechnet. Drei Gene werden als Kontrollen für die Normalisierung in C2C12 (Ppia, Gapdh, 5S oder Dusp6, Rragc, 5S) und Skelettmuskeln (Rpl13a, Ppia, Myh4) verwendet. Fehlerbalken stellen SD aus den Mittelwerten von Dreifachversuchen aus 3 unabhängigen Experimenten mit C2C12-Zellen und 3 Mäusen pro Gruppe dar. NS nicht signifikant (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, *** P < 0,001. Schüler-T-Test.

Um herauszufinden, ob andere Agrn-Isoformen mit Flunarizin produziert werden könnten, haben wir RT-qPCR-Primer für Agrn-Exons entwickelt, nämlich NtA, Tm, ex5-6 (in allen Isoformen enthalten), ex29-30 (3'-Region aller Isoformen) und die Einbeziehung des Y-Einsatzes (Ergänzungstabelle 2). Die C2C12-Differenzierung war mit einer Abnahme der gesamten Agrn-mRNA-Spiegel (ex5–6) und einem erhöhten Einschluss des Y-Inserts verbunden (Abb. 2C). Die NtA-Werte blieben bei der Differenzierung unverändert, die Tm-Werte waren jedoch deutlich verringert. Flunarizin reduzierte die NtA-Exon-Spiegel in C2C12-Myotubes um etwa 25 %, wobei die Exon/Ex5-6-Verhältnisse unverändert blieben (Abb. 2D). Darüber hinaus zeigte das Verhältnis von NtA zu Tm, dass es mehr NtA- als Tm-Isoformen gibt (wie erwartet) und dass bei der Differenzierung ein Anstieg von NtA gegenüber Tm-Isoformen sowie eine Verringerung durch Flunarizin zu beobachten ist (Abb. 2E). So fanden wir heraus, dass Flunarizin-induzierte AChR-Clusterbildung mit Y+Z− Agrn-Isoformen in C2C12-Myotubes korreliert.

Um die Agrn-Expression in der Skelettmuskulatur zu untersuchen, untersuchten wir die Agrn-Exon-Spiegel in drei Hinterbeinmuskeln, nämlich Soleus, Plantaris und Tibialis, von mit Vehikel (V) und Flunarizin (FZ) behandelten Kontrollmäusen (Heterozygoten) und SMA-Modellmäusen am postnatalen Tag 10 (P10). Diese Muskeln unterscheiden sich hinsichtlich der Reifezeit, was durch den Anteil embryonaler und neonataler Myosin-Isoformen und durch die Zusammensetzung der Typ-I- und Typ-II-Fasern angezeigt wird43. Die Reifung von zwei Streckmuskeln (Soleus und Plantaris) ist bei SMA-Modellmäusen verändert, während der Flexor tibialis weniger betroffen ist, wie durch die Expression der schweren Kette von Myosin bei Neugeborenen angezeigt17,43. Wir haben einen Zeitpunkt gewählt, um spezifische Effekte und nicht ante-mortem-Änderungen aufgrund des Mutantentodes bei ≈12 Tagen widerzuspiegeln43. Bei SMA tibialis und Soleus wurde eine deutliche Verringerung der Agrn ex5-6-Spiegel um 60 bis 80 % beobachtet, während bei SMA plantaris im Vergleich zu den Kontrollen eine geringfügige Verringerung um ca. 15 % festgestellt wurde (Abb. 2F–H). Sowohl NtA- als auch Tm-Exons waren in SMA soleus reduziert, während nur NtA in SMA plantaris und tibialis vorhanden war, was auf einen Mangel an sekretorischen Isoformen in SMA-Muskeln hinweist, die mit Flunarizin nur in tibialis wiederhergestellt wurden. Darüber hinaus erhöhte Flunarizin in ähnlicher Weise die Agrn-Exon-Spiegel in der Kontrollgruppe und in SMA tibialis. NtA-Exon wurde in Kontrollen und SMA soleus und tibialis bevorzugt gegenüber Tm exprimiert, fand sich jedoch gleichermaßen in SMA plantaris (Abb. 2I – K). Obwohl die ex5-6-Spiegel in mit Flunarizin behandelten SMA soleus und plantaris verringert waren, war das Tm/ex5-6-Verhältnis erhöht, was darauf hindeutet, dass die beiden Transkriptionsstartstellen nicht gleichermaßen empfindlich auf das Arzneimittel reagieren (Abb. 2L – N). Auch das Y-Exon/Ex5-6-Verhältnis zeigte mit Flunarizin einen ähnlichen Wert wie die Kontrollen bei SMA plantaris und tibialis, jedoch nicht bei Soleus. Somit wird die Expression von Agrn-Isoformen in SMA-Mäusen auf muskelspezifische Weise verändert, die durch Flunarizin moduliert wird.

Das Fehlen einer vollständigen Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von Agrn-Isoformen (Abb. 2) und der Wirkung von Flunarizin auf die NMJ-Größe43 legt nahe, dass zusätzliche Ereignisse zu den Arzneimittelwirkungen beitragen. Da Flunarizin als Blocker der T-Typ-Kalziumkanäle Cav3.1, Cav3.2 und Cav3.3 eingestuft ist, die von den Genen Cacna1g, Cacna1h bzw. Cacna1i kodiert werden44, untersuchten wir anschließend, ob das Medikament die Cacna1h-Expression modulieren kann. Bemerkenswert ist, dass die Cacna1g- und Cacna1i-Transkripte unterhalb unserer Offenbarungsgrenzen lagen und daher nicht nachweisbar sind. Daher wurden Primer für die Analyse der Expression und des Spleißens des Cacna1h-Gens entworfen und validiert: ex2-3 (Exons, die ein U12-abhängiges Intron flankieren), ex15-16 (in allen Cacna1h-mRNAs enthalten), ex25 (alternativ gespleißtes Exon 25) und ex32-33-Primer (3'-Region in allen Cacna1h-mRNAs) (Ergänzungstabelle 2, Abb. 3A). Die Ex15-16-Spiegel waren zwischen C2C12-Myoblasten und Myotubes ähnlich, wohingegen die Ex2-3- und ex25-Spiegel mit der Differenzierung anstiegen (Abb. 3B). Flunarizin reduzierte die ex15-16- und ex25-Spiegel um 50 bzw. 40 %, hatte jedoch keinen Einfluss auf die ex2-3-Spiegel in den Myotubes. Wir haben die Exon/Ex15-16-Verhältnisse weiter ausgewertet (Abb. 3C). Der erwartete Wert von 1 wurde mit dem Medikament für das ex32-33/ex15-16-Verhältnis erhalten, während für das ex2-3/ex15-16-Verhältnis ein etwa dreifacher Anstieg festgestellt wurde, was auf ein relativ erhöhtes Spleißen des U12-Introns in Cacna1h-Transkripten hinweist. Darüber hinaus zeigten wir eine 25-prozentige Reduzierung der Cav3.2-Proteinspiegel in mit Flunarizin behandelten C2C12-Myotubes (Abb. 3D). Unsere Ergebnisse bestätigten auch die Spezifität der hier verwendeten Antikörper. Da U12-Introns langsamer entfernt werden als U2-Introns, bestimmen sie die Expressionsniveaus reifer Transkripte61. Somit senkt Flunarizin in vitro die Cacna1h-mRNA-Spiegel, die teilweise durch die Entfernung von U12-Introns kompensiert werden. Eine geringfügige snRNA-Genabgabe verbessert den Krankheitsphänotyp bei SMA-Mäusen62. Obwohl die snRNA-Spiegel mit dem Medikament unverändert blieben (ergänzende Abbildung 1), assoziieren unsere Daten kleinere U12-Spleißosomen als potenzielle Ziele des Medikaments in C2C12-Myotubes.

Auswirkungen von Flunarizin auf die Expression und das Spleißprofil des Cacna1h-Gens in C2C12-Myotubes und Skelettmuskeln von SMA-Modellmäusen. (A) Schematische Darstellung des U12-Introns flankiert von Exon 2 und 3 (ex2-3) und des alternativ gespleißten Exon 25 des Cacna1h-Gens. (B) Die RT-qPCR-Analyse der RNA-Spiegel der Exons ex2-3, ex15-16, ex25 und ex29-30 des Cacan1h-Gens wird in C2C12-Myotubes im Vergleich zu Myoblasten im Proliferationsmedium (PM) durchgeführt. (C) Die Expressionsverhältnisse zwischen Exons und ex15-16-RNA-Spiegeln, wobei ex15-16 in allen Cacna1h-mRNAs vorhanden ist. Gesamt-RNA wird aus C2C12-Myoblasten hergestellt, die in Proliferationsmedium (PM) oder nach 7 Tagen in Differenzierungsmedium (Diff7) mit entweder DMSO oder Flunarizin (FZ) für die letzten 16 Stunden gezüchtet wurden. (D) Die Immunoblot-Analyse des von Cacna1h kodierten Proteins Cav3.2 bestätigt eine signifikante Reduzierung der Proteinmengen in Gesamtproteinextrakten von C2C12-Myotubes um 20 % durch Flunarizin (n = 3). Unbeschnittene Bilder sind in der ergänzenden Abbildung 3 zu finden. (E–G) RNA-Spiegel von Cacan1h-Exons werden bei P10 im Soleus, Plantaris bzw. Tibialis bestimmt. (H–J) Expressionsverhältnisse zwischen Exons und ex5-6-RNA-Spiegeln werden für Soleus, Plantaris bzw. Tibialis berechnet. Fehlerbalken stellen SD aus den Mittelwerten von Dreifachversuchen aus 3 unabhängigen Experimenten mit C2C12-Zellen und 3 Mäusen pro Gruppe dar. NS, nicht signifikant (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001. Schüler-T-Test.

Als nächstes haben wir die Cacna1h-Genexpression in den Skelettmuskeln von Kontroll- und SMA-Mäusen gemessen (Abb. 3E – J). Wir haben gezeigt, dass die ex15-16-Spiegel in SMA-Mutanten sowie die Auswirkungen von Flunarizin auf Kontrollen und Mutanten muskelspezifisch waren. Tatsächlich wurde bei SMA soleus eine dreifache Verringerung der ex15-16-Spiegel beobachtet, während bei SMA plantaris im Vergleich zu den Kontrollen ein etwa fünffacher Anstieg festgestellt wurde (Abb. 3E–G). Flunarizin reduzierte die erhöhten ex15-16-Spiegel bei SMA plantaris, stellte die Werte bei SMA soleus jedoch nicht wieder her. Ähnlich wie beim Agrn-Gen (Abb. 2H) exprimierte SMA tibialis ebenso viele Cacna1h-mRNA-Spiegel wie die Kontrollen und stieg in ähnlicher Weise mit dem Arzneimittel an (Abb. 3G). Die alternativen ex25-Spiegel waren bei SMA plantaris und tibialis im Vergleich zu den Kontrollen erhöht, während sie bei SMA soleus verringert waren. Flunarizin korrigierte den relativen ex25-Einschluss in mRNAs von SMA tibialis, erhöhte ihn jedoch in Kontroll-Plantaris. Das Verhältnis ex2-3/ex15-16 blieb bei mit Flunarizin behandelten SMA soleus und plantaris niedrig, was darauf hindeutet, dass die Retention des U12-Introns bestehen blieb. Wichtig ist, dass das ex32-33/ex15-16-Verhältnis bei mit Flunarizin behandelten SMA plantaris einen Wert von 1 zeigte, was auf einen Anstieg der mRNAs voller Länge mit dem Medikament hindeutet.

CaV3.2-Strom wurde in neugeborenen Muskelfasern von Mäusen nachgewiesen63. Anschließend fragten wir, ob die Verteilung von Cav3.2 in den Muskelfasern durch Flunarizin beeinflusst wurde. Zu diesem Zweck führten wir Co-Markierungs-Immunfluoreszenzexperimente mit Anti-Typ-I-MyHC7-Antikörpern (langsame Typ-I-Fasern) und Anti-Cav3.2-Antikörpern auf Serienschnitten von Kontroll- und SMA-Plantaris bei P5 und P10 durch (Abb. 4A, ergänzende Abb. 8). Die SMA-Mäuse beginnen bei P543 Symptome zu entwickeln. Die Anti-Cav3.2-Antikörper zeigten eine zytoplasmatische und membranöse Markierung von Myofasern. Eine Verringerung der Gesamtfluoreszenz in Myofasern vom Typ I zwischen P5 und P10 wurde unter allen Bedingungen beobachtet, mit Ausnahme der mit Vehikel behandelten Kontrollen (Abb. 4B). Die mit Flunarizin behandelten SMA-Typ-I-Fasern erholten sich bei P10 im Vergleich zu mit Vehikel behandelten SMA-Fasern wieder bei der zytoplasmatischen Fluoreszenz. Flunarizin hatte bei den Kontrollen keine Auswirkungen auf die gesamte Cav3.2-Fluoreszenzintensität von MyHC7-negativen Fasern (vermutlich schneller Typ II), wohingegen bei diesen SMA-Fasern ein Anstieg beobachtet wurde. Daher reagiert jeder Fasertyp unterschiedlich auf Flunarizin.

Flunarizin verhindert die Verringerung der Myofaser-Cav3.2-Immunmarkierung während der Neugeborenenentwicklung bei SMA-Mäusen. (A) Muskelfaser-Immunfärbung mit Cav3.2 (grün) und MyHC7 (rot) wird für die Plantaris von mit Vehikel (V) und Flunarizin (FZ) behandelten Kontroll- und SMA-Mäusen bei P5 bzw. P10 gezeigt. Die Originalbilder sind in der ergänzenden Abbildung dargestellt. 8. (B) Gezeigt wird die normalisierte Fluoreszenzintensität einzelner Muskelfasern für Cav3.2, die in Panel A erkannt wurde. Jedes Symbol stellt den Gesamtwert der Fluoreszenzintensität in einer Faser dar. Der Mittelwert der Fluoreszenz ist in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Die Verteilung der immunmarkierten oder unmarkierten MyHC7-Fasern für die 4 Mäusegruppen wird unter Verwendung des Student-t-Tests verglichen. NS nicht signifikant (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 Mäuse pro Gruppe). Maßstabsbalken, 50 μm.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Cav3.2 in Motoneuronen64,65, Blutgefäßen66 und sensorischen Afferenzen der Muskeln, jedoch nicht in Schwann-Zellen67, exprimiert wird und dass alle diese Zelltypen im Muskelgewebe vorhanden sind. Wir haben uns hier auf die Cav3.2-Membranmarkierung von Myofasern und NMJs konzentriert und dabei Cav3.2-markierte Muskelabschnitte bei P10 untersucht, die mit einem fluoreszierenden α-BTX gegengefärbt wurden, um AChRs zu markieren (Abb. 5A – D). Unsere Immunfluoreszenzexperimente zeigten in P5- und P10-Muskelschnitten, dass die Immunreaktivität von Cav3.2 der der Markierung mit dem fluoreszierenden α-BTX nahe kam, was darauf hindeutet, dass Cav3.2 in der Nähe von NMJs vorhanden ist. Wir haben auch gezeigt, dass Flunarizin die Immunfärbung von Cav3.2 in der Nähe von NMJs in SMA-Muskeln verstärkt (Abb. 5D). Daher könnte eine fehlerhafte Cav3.2-Verteilung in Myofasern zur SMA-Pathogenese beitragen.

Das Cav3.2-Protein ist in der Nähe der neuromuskulären Verbindung angereichert und sein Mangel wird durch Flunarizin in den Muskeln von SMA-Mäusen verbessert. (A) Schematische Darstellung der Cav3.2-Immunmarkierung am postsynaptischen NMJ. MN Motoneuron, SC Schwann-Zellen, SM Skelettmuskel. (B) Das Fluoreszenzexperiment von Cav3.2 zeigt die Markierung in der Nähe postsynaptischer Stellen eines NMJ mithilfe der α-BTX-Färbung von AChRs und innerhalb seines Motoneurons in Kryostatschnitten von P5 plantaris von mit Vehikel behandelten Kontrollmäusen. Das Bild ist eine fokussierte α-BTX-Färbung. (C) Das Fluoreszenzexperiment deckt die Ansammlung von Cav3.2 in der Nähe postsynaptischer Stellen der NMJs auf, wie durch die α-BTX-Färbung von AChRs in Kryostatschnitten von P10 plantaris von Kontrollmäusen (oberes Feld), die Reduktion (mittleres Feld) und die Wiederherstellung nachgewiesen wird bei SMA-Mäusen mit Flunarizin (unteres Feld). Maßstabsbalken, 10 μm. (D) Gezeigt wird die normalisierte mittlere Fluoreszenzintensität einzelner NMJ für Cav3.2, die in Panel B nachgewiesen wurde. Jedes Symbol stellt den Mittelwert der Fluoreszenzintensität einzelner NMJ dar. Der Fluoreszenz der mit Vehikel behandelten Kontrollfasern bei P5 wird ein willkürlicher Wert von 1 zugewiesen. Die Verteilung von Cav3.2-immunmarkiertem NMJ für die 4 Mäusegruppen wird mithilfe des Mann-Whitney-Tests unter Verwendung von GraphPad verglichen. NS, nicht signifikant (P > 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (3 Mäuse pro Gruppe, insgesamt 600 NMJs).

Um zu untersuchen, ob Flunarizin die Proteininteraktion zwischen Cav3.2 und dem Agrin-LRP4-MuSK-Signalweg moduliert, wurden die C2C12-Myotubes mit dem Medikament behandelt, fixiert und mithilfe eines In-Cell-Co-Immunpräzipitations-Proteinligationstests (PLA) mit in verschiedenen generierten Antikörpern bewertet Spezies und spezifisch für jedes Protein (Abb. 6). Wir konzentrierten uns auf Proteine, die für die AChR-Clusterbildung entscheidend sind, und testeten die folgenden Paare: LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-Integrin β1, MuSK-Phosphotyrosine, Integrine α11-β1 und Dyn2-Integrin β1. Die PLA-positiven Signale zwischen zwei Proteinen in unmittelbarer Nähe (< 40 nm) erschienen als fluoreszierende Punkte, die zwischen DMSO- und Flunarizin-behandelten C2C12-Myotubes verglichen werden können. Für alle Kombinationen wurden spezifische PLA-Signale erkannt. Die positiven Signale mit LRP4-Cav3.2- und LRP4-MuSK-Kombinationen deuteten auf konstitutive Proteinassoziationen in C2C12-Myotubes hin. Wir fanden auch heraus, dass Flunarizin die Assoziation von Integrin-β1 sowohl mit MuSK als auch mit Integrin-α11 verstärkt, während die Dyn2-Integrin-β1-Assoziation verringert wurde (Abb. 6B). Obwohl in löslichen Immunpräzipitationsproteinfraktionen keine MuSK-Phosphorylierung nachgewiesen wurde (ergänzende Abbildung 10), wurden mit MuSK und Phosphotyrosinen erzeugte PLA-Signale durch Flunarizin deutlich erhöht. Somit verändert Flunarizin die enge(n) Assoziation(en) wichtiger NMJ-Proteine.

Visualisierung wichtiger NMJ-Proteininteraktionen in mit Flunarizin behandelten C2C12-Myotubes. (A) In-situ-PLA-Nachweis endogener Proteininteraktionen in C2C12-Myotubes mit spezifischen Antikörpern für die folgenden Proteinpaare: LRP4-MuSK, LRP4-Cav3.2, MuSK-Integrin β1, Integrin α11-β1, Dyn2-Integrin β1 und MuSK- Phosphotyrosine. Als Negativkontrollen wird ein Primärantikörper weggelassen oder durch einen Negativkontrollantikörper (DAKO) ersetzt. Die positiven PLA-Signale werden als helle Punkte angezeigt. (B) Gezeigt wird die fache Änderung der mittleren Fluoreszenzintensität einzelner C2C12-Myotubes, die in Panel A nachgewiesen wurden. Die Anzahl der mit ImageJ analysierten Myotubes finden Sie in der ergänzenden Tabelle 3. Maßstabsbalken, 30 μm.

Oxidative Schäden könnten auch zu NMJ-Veränderungen bei Motoneuronerkrankungen beitragen68. Flunarizin reduziert das Prooxidans TXNIP in Fibroblasten von SMA-Patienten56 wie andere Kalziumkanalblocker in Pankreas-Betazellen69. Interessanterweise waren die Txnip-Transkripte in Muskeln ohne Satellitenzellen (SC) hochreguliert, im Vergleich zu Muskeln mit vielen SC,70 was an eine verringerte SC-Anzahl in Muskeln von SMA-Mäusen erinnert71,72,73. Wir untersuchten die Txnip-Expression in den Muskeln von mit Flunarizin behandelten SMA-Mäusen (Abb. 7). Flunarizin reduzierte die hochregulierten Txnip-mRNA-Spiegel in SMA-Muskeln (Abb. 7A). Immunfluoreszenz-Co-Markierungsexperimente mit Antikörpern gegen TXNIP und MyHC7 (Typ-I-Fasern) ergaben, dass alle neonatalen Myofasern TXNIP-positiv waren, wobei 2 % bei den Kontrollen stark markiert waren, während sich 16 % im SMA soleus befanden und mit Flunarizin auf 10 % reduziert wurden (Abb . 7B,C). Dies passt zu einer hohen TXNIP-Expression in stillgelegten erwachsenen Mäuse- und Rattenmuskeln74. Somit reduziert Flunarizin die erhöhten Txnip-mRNA-Spiegel in den Muskeln von SMA-Mäusen.

Flunarizin reduziert die erhöhten Txnip-Expressionsniveaus in der Skelettmuskulatur von SMA-Modellmäusen. (A) Txnip-RNA-Spiegel im Soleus, Plantaris und Tibialis in mit Vehikel (V) und Flunarizin (FZ) behandelten Kontrollen (Ctrl) und SMA-Modellmäusen. Der mit Vehikel behandelten Kontrolle (Strg V) wird ein willkürlicher Wert von 1 zugewiesen. NS nicht signifikant (P > 0,05), *P < 0,05, ** < 0,01, ***P < 0,001, Student-t-Test (3 Mäuse pro Gruppe). ). (B) Muskelfaser-Immunfärbung mit Anti-TXNIP- (grün) und Anti-MyHC7-Antikörpern (rot) wird für den Soleus von mit Vehikel und Flunarizin behandelten Kontroll- und SMA-Mäusen bei P11 gezeigt. (C) Die Spalten stellen den Prozentsatz der Fasern dar, die stark TXNIP-positiv sind (3 Mäuse pro Gruppe). Fehlerbalken stellen SD aus den Mittelwerten dar. Maßstabsbalken, 30 μm.

Für SMA-Patienten gibt es drei SMN-wiederherstellende Therapien, die das Überleben und die motorische Funktion verbessern. Allerdings ist das Ansprechen der Patienten auf die Behandlungen unterschiedlich. Daher sollten zusätzliche therapeutische Ziele identifiziert werden, um bestehende SMA-Therapien zu optimieren oder neue zu implementieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass Flunarizin die Myofasergröße, die NMJ-Fläche und die Innervation bei SMA-Modellmäusen erhöht43. Wir haben uns hier auf die Skelettmuskulatur konzentriert, um Flunarizin auf NMJs zu beurteilen. Wir zeigen, dass Flunarizin Agrin-Signalwege modulieren kann, die an der Bildung und Reifung von NMJ beteiligt sind, was weitere Einblicke in die SMA-Pathogenese liefert.

Mausmodelle und Patienten mit Motoneuron-Krankheit weisen NMJ-Defekte auf75,76. Synaptische Dysfunktion ist ein frühes Ereignis bei SMA, das Veränderungen in sensorisch-motorischen Schaltkreisen hervorruft77,78,79. SMA ist eine retrograde Neuropathologie, bei der die Degeneration von Motoneuronen an präsynaptischen NMJs beginnt und sich auf Zellkörper auswirkt15. In Mausmodellen mit schwerer SMA sind die Motoneuronenzahlen bei der Geburt normal und sinken um den dritten Tag nach der Geburt auf 580,81. Die postnatale NMJ-Reifung erfolgt in den ersten drei bis vier Wochen nach der Geburt. Während dieser Zeit vergrößern sich die NMJs und ihre Morphologie ändert sich von ovalen zu perforierten Plaques, um eine brezelartige Form zu erreichen82. Der Cav3.2-Strom ist in perinatalen Muskelfasern hoch, nimmt in den drei bis vier Wochen nach der Geburt zunehmend ab und ist in erwachsenen Muskeln nicht nachweisbar, außer während der Muskelregeneration und -reparatur63. Diese Entwicklungsphase stellt hohe Anforderungen an SMN und ist die Zeit, in der der durch SMN-Mangel verursachte motorische Phänotyp durch SMN-basierte Therapien wiederhergestellt werden kann83,84,85. Dies ist auch der Fall, wenn SMN-unabhängige Therapien den Krankheitsphänotyp verbessern12,43,86,87,88.

Der stimulierte Agrin/LRP4/MuSK-Signalweg lindert SMA und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)89. Agrin ist ein Schlüsselmolekül in der postsynaptischen NMJ-Biologie. Veränderungen in den Agrin-Isoformen wirken sich auf die Bildung, Reifung und Stabilität von NMJ aus23. Das Agrn-Gen verfügt über alternativ gespleißte Y- und Z-Exons. Isoformen mit Z-Stellen (Z+) sind an NMJs synaptogen, wohingegen Isoformen ohne Z-Stellen (Z-) in vivo eine geringe AChR-Clusteraktivität aufweisen90. Motoneuronen exprimieren Z+-Agrin, während Muskelzellen dies nicht tun. Z-Agrin hat auch Funktionen: Es kann die AChR-Phosphorylierung modulieren91, die AChR-Genexpression stimulieren92,93 und unter bestimmten Bedingungen die AChR-Clusterbildung induzieren60,94,95. Z-Agrin kann Myotube-Zelloberflächenproteine ​​wie neurale Zelladhäsionsmoleküle, α-Dystroglycan, Laminine und Integrine binden28,96,97,98,99. Z+ Agrin kann diese Proteine ​​auch binden, aber das α-Dystroglycan bindet Z- Agrin stärker als Z+ Agrin. Darüber hinaus verändert die Y-Stelle die Wechselwirkungen, wobei das Y-Z−-Agrin die höchste Bindung an α-Dystroglycan aufweist90. Die Flunarizin-modulierte Y-Stelle beeinflusst auch die Aktivität von α-Dystroglycan bei der Reaktion in den SMA-Muskeln.

Am 10. Tag nach der Geburt ist jeder Skelettmuskel hinsichtlich seiner Reifung sehr unterschiedlich. Der embryonale MyHC bleibt noch einige Zeit nach der Geburt bestehen. Der Soleus ist der weniger ausgereifte Muskel, da ein größerer Anteil embryonaler Fasern (60 %) als bei Plantaris (30 %) und Tibialis (20 %) vorhanden ist43. Zwei Agrn-Promotoren produzieren Transkripte mit entweder NtA oder Tm, dem ersten Exon, das für sekretierte bzw. Transmembran-Isoformen kodiert. Sowohl Motoneuronen als auch Myofasern exprimieren das NtA-Exon, das eine Laminin-bindende Domäne kodiert27. Es wurde gezeigt, dass Smn-defiziente Motoneuronen aus SMA-Mäusen nicht auf Laminine reagieren100, was mit einer Verringerung von NtA-Agrin vereinbar ist. Die deutliche NtA-Reduktion, die wir auch in SMA-Muskeln beobachteten, deutet auf eine veränderte Expression in beiden Zelltypen hin. NtA- und Tm-Exons sind in SMA-Muskeln nicht gleichermaßen betroffen und reagieren entwicklungs-/muskelspezifisch unterschiedlich auf das Medikament, wobei sich die reiferen SMA tibialis wie Kontrollen verhalten. Tm-Exon wird in vivo fast ausschließlich von Neuronen27 und in Muskeln von Neuronen exprimiert, die Myofasern innervieren. In den SMA-Muskeln werden unterschiedliche Tm-Exon-Spiegel beobachtet, was auf einen Unterschied in den Skelett-Motoneuronen101 und/oder in den retrograden Signalen der Myofasern14 hindeutet.

Obwohl ein Tm-Exon-Schwellenwert mit den Auswirkungen von Flunarizin auf die NMJ-Größe bei SMA plantaris und tibialis korreliert43, müssen zusätzliche Mechanismen berücksichtigt werden, um zu erklären, wie er bei SMA plantaris auftritt (ähnliche Tm-Werte zwischen Vehikel und Flunarizin). Es wurde gezeigt, dass die Y-Stelle Tm-Agrin an erregenden synapsenähnlichen Spezialisierungen im Zentralnervensystem moduliert34. Diese Autoren schlugen vor, dass eine indirekte Wechselwirkung von Tm-Agrin und LRP4 erforderlich ist, um Proteine ​​an der postsynaptischen Membran zu bündeln. Es ist möglich, dass Cav3.2 indirekte Interaktionen vermittelt. Andere Studien haben gezeigt, dass Integrin-β1 die Wechselwirkung zwischen Agrin und α-Dystroglycan vermitteln könnte28,57. Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass Cav3.2 ein Agrin-Corezeptor bei der frühen postsynaptischen NMJ-Differenzierung sein könnte.

Was das Cacna1h-Gen (das für Cav3.2 kodiert) betrifft, so ist dessen U12-abhängiges Intron-Spleißen des Cacna1h-Gens in SMA-Mäusen verändert47. Die Motoneuronerkrankung ALS und eine schwere angeborene Amyotrophie werden mit genetischen Cacna1h-Varianten als Risikofaktoren in Verbindung gebracht102,103,104,105. Interessanterweise begrenzen andere Arten von Kalziumkanälen, nämlich der P/Q-Typ, die Lokalisierung und Aktivierung von MuSK und verhindern die AChR-Clusterbildung in extrasynaptischen Domänen von Myofasern106. Interessant ist, dass ein Blocker von T-Typ-Kalziumkanälen die Expression von Cacna1h auf RNA- und Proteinebene modulieren kann. Der Grund könnte die geringe Selektivität des Arzneimittels für Cav3-Kanäle sein107. Es ist verlockend zu spekulieren, dass die Hemmung von T-Typ-Kanälen die Wirkung von Flunarizin teilweise erklärt. Die verlängerte Wirkung von Flunarizin auf die Stromhemmung von Cav3.2 unterstützt die Rolle dieses Kanals (ergänzende Abbildung 7). Flunarizin könnte eine Rückkopplungsschleife auf die Cacna1h-Expression fördern, indem es die intrazellulären Ca2+-Spiegel verändert, was NMJ-Defekten in SMA plantaris und tibialis entgegenwirkt. Dies steht im Einklang mit der Rolle des veränderten RNA-Metabolismus bei SMA und ALS108 und den Auswirkungen von Flunarizin auf das RNA-Spleißen45. Unsere Ergebnisse sind auch für andere Erkrankungen des Menschen von großer Bedeutung, was darauf hindeutet, dass Flunarizin bei jungen Patienten, die an einer durch dominant-negative Cav3.2-Mutationen verursachten Kanalopathie leiden, schädlich sein könnte109.

Calcium ist ein wichtiger Regulator in der Biologie der Skelettmuskulatur. Die Bildung und Aufrechterhaltung von AChR-Clustern umfasste intrazelluläres und extrazelluläres Kalzium110,111. In Mäusemuskeln erreicht Cav3.2 seinen Höhepunkt um den Embryonaltag E16, der mit dem späten embryonalen NMJ-Reifungsschritt zusammenfällt. Tatsächlich sind aneurale AChR-Cluster bei E11–12,5 vorhanden, dann findet eine Innervation statt (E12,5–E14) und aneurale Cluster lösen sich bei E14–E17 auf und nur innervierte Cluster verbleiben auf den Myofasern20. In diesem Zeitraum findet auch die Myogenese statt. Von E14.5 bis zur Geburt haften Myoblasten an Primärfasern und verschmelzen mit ihnen, um sekundäre Myofasern zu bilden112. Der Cav3.2-Strom wird in vitro aktiviert, wenn Myoblasten zu Myotubes verschmelzen113. Dies könnte die verringerte Muskelgröße bei SMA-Mäusen erklären. Eine verringerte Anzahl an Myofasern in SMA soleus und plantaris43 korreliert hier mit den verringerten Cacna1h-RNA-Spiegeln. Flunarizin erhöht die Fasergröße und -anzahl, um die Atrophie des SMA soleus zu reduzieren, aber nur die Fasergröße, um die Atrophie des SMA plantaris zu korrigieren43. Das postnatale Muskelwachstum erfolgt normalerweise durch eine Vergrößerung der Faserfläche, nicht jedoch durch eine Vergrößerung der Faseranzahl20,114. Diese Beobachtungen könnten auf einen Unterschied in den Myofasertypen und ihrer jeweiligen Expression von Cav3.2 hinweisen, wie hier gezeigt. Der Soleus weist einen Anteil von 50–50 % an langsamen Typ-I- und schnellen Typ-II-Fasern auf. Plantaris und Tibialis enthalten einen geringen Anteil an Typ-I-Fasern (10–20 %), der während der postnatalen Entwicklung fast vollständig verschwindet. Der Kalziumspiegel im Ruhezustand ist in langsamen Fasern höher als in schnellen Fasern. Daher haben Kalziumtransienten aufgrund der Konzentrationsunterschiede in den Proteinen, die die Kalziumhomöostase steuern, in beiden Fasern unterschiedliche Auswirkungen. Calcium kann die Calmodulin-regulierte Phosphatase Calcineurin und Calcium-abhängige Proteasen aktivieren. In langsamen Muskelfasern reguliert Calcineurin die nukleare Translokation des Transkriptionsfaktors NFATc1, der das langsame Genprogramm steuert. Darüber hinaus induziert ein erhöhter Kalziumeinstrom durch Cav3.2 die hypertrophe Signalübertragung von kardialem Calcineurin/NFAT115. Da der Umgang mit Kalzium in SMA50 verändert ist, könnte Flunarizin die Expression anderer Muskelgene modulieren, die in Zukunft noch identifiziert werden müssen.

Unsere Beobachtung, dass Cav3.2 in unmittelbarer Nähe von LRP4 in C2C12-Myotubes gefunden wird, wirft die Frage nach seiner möglichen Lokalisierung in der Nähe der NMJs während der perinatalen Entwicklung auf. Wir können spekulieren, verstehen aber noch nicht vollständig, warum Cav3.2 in der Nähe von NMJs lokalisiert ist. Ein interessantes Merkmal von Cav3.2 ist das Vorhandensein einer PDZ-Bindungsdomäne in seinem zytoplasmatischen C-Terminus116. PDZ-Proteine ​​könnten die Aktivität von Kalziumkanälen steuern, ihre Plasmamembrandichte regulieren und nachgeschaltete Signalwege beeinflussen117. Am postsynaptischen NMJ finden sich mehrere PDZ-Gerüstproteine, darunter die neuronale Stickoxid-Synthetase (nNOS) und α-Syntrophin118,119, MAGI-1c120 und die PDZ-Domäne mit dem RING-Finger 3 (PDZRN3)121. Somit kann die NMJ-Lokalisierung von Cav3.2 durch den vorherigen Bericht erklärt werden, dass die PDZ-Domäne von nNOS in vitro mit der PDZ-Bindungsdomäne von Cav3.2122 interagiert. Dies ist besonders interessant im Zusammenhang mit SMA und ALS, wo die Immunfärbung für nNOS am Sarkolemm atrophischer Fasern in Muskelbiopsien von Patienten reduziert/aufgehoben ist und an hypertrophen Fasern (ein Hinweis auf Innervation) in SMA-Biopsien erhalten bleibt123,124. Dieses Ergebnis ist in vielerlei Hinsicht bemerkenswert, da Flunarizin Auswirkungen auf die Muskeln von SMA-Mäusen hat. Die nNOS-Aktivität reguliert die Kalziumhomöostase125, fördert die AChR-Clusterbildung in vivo und vergrößert NMJs126. Im Hinblick auf die NMJ-Entwicklung ist die Wnt-Induktion der AChR-Clusterbildung komplex. Die RNA-Analyse identifizierte die Wnt4- und Wnt9a-Expression in C2C12-Myotubes127, die weder durch Flunarizin noch durch AChR-Untereinheiten und nachgeschaltete YAP-Ziele verändert werden (ergänzende Abbildungen 5 und 6). Die Erforschung der Rolle von Wnts bei der Flunarizin-induzierten AChR-Clusterbildung könnte in Zukunft zusätzliche Erkenntnisse liefern. In Anbetracht der wenigen gestörten Bahnen in der Skelettmuskulatur von SMA-Mäusembryos128 mit fehlregulierten Muskelbahnen nach der Geburt37,88,129,130 ​​verdeutlichen unsere Ergebnisse die Bedeutung der Untersuchung der Arzneimittelwirkungen während der Neugeborenenentwicklung bei SMA-Mäusen. Mit einem besseren Verständnis der Reaktionen auf Flunarizin könnte es möglich sein, die bestehenden Behandlungen auf kombinierte Therapien gegen Motoneuronerkrankungen auszuweiten.

C2C12-Muskelzellen wurden auf TPP-Kulturschalen in DMEM-Glutamax, ergänzt mit 20 % fötalem Kälberserum (FCS) sowie Penicillin und Streptomycin (100 Einheiten/ml), gezüchtet und in DMEM-Glutamax mit 2 % Pferdeserum differenziert. Nach 6 Tagen im Differenzierungsmedium wurden Myotubes über Nacht mit Flunarizin (4 μM, wie von Sigma-Aldrich für die Lopac-Bibliothek L6912, Cav3.2 Calciumstrom IC50 empfohlen) oder DMSO (1 μl/ml) behandelt, wie schematisch in Abb. 2a dargestellt . Für die Experimente mit blockierenden Antikörpern (1:100, laut Literatur) wurden diese eine Stunde vor den Molekülen in die Myotubes gegeben. Für die Fluoreszenzmikroskopie wurden Myotubes mit PBS gespült und 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 3 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 fixiert und in PBS gespült. AChR-Cluster wurden mit Alexa Fluor 488 oder 555-konjugiertem α-Bungarotoxin (2 μg/ml, Molecular Probes) sichtbar gemacht. Für das Western Blot wurden die Gesamtproteinextrakte auf 10 % ProSieve 50-Polyacrylamidgel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) in Tris-Tricine-Laufpuffer aufgelöst, auf PVDF-Membranen (Millipore) übertragen und mit den in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten Antikörpern inkubiert Im Waschschritt der Inkubation mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern wurden die Proteine ​​mittels Chemilumineszenz sichtbar gemacht (Amersham ECL, GE Healthcare) und mithilfe der Gelanalyse von ImageJ quantifiziert. Für elektrophysiologische Aufzeichnungen wurde HEK293, das hCaV3.2 stabil exprimiert, mit DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % FBS, 1 mM L-Glutamin, 1 mM Penicillin/Streptomycin, kultiviert und mit 800 µg/ml Geneticin G418 vervollständigt.

Für elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden Trypsinzellen 4 Minuten lang bei 800 U/min zentrifugiert und in extrazellulärer Patch-Clamp-Lösung resuspendiert (ca. 350.000 Zellen ml). Ganzzellaufzeichnungen wurden verwendet, um die Auswirkungen von Flunarizin auf Cav3.2-exprimierende HEK293-Zellen zu untersuchen. Automatisierte Patch-Clamp-Aufnahmen wurden mit dem SyncroPatch 384PE von Nanion (München, Deutschland) durchgeführt. Für elektrophysiologische Aufzeichnungen wurden Chips mit Einzellöchern mittleren Widerstands (n = 384) verwendet. Die Impulserzeugung und Datenerfassung wurden mit der Software PatchControl384 v1.9.7 (Nanion) und der Biomek-Schnittstelle (Beckman Coulter) durchgeführt. Ganzzellaufzeichnungen wurden gemäß den empfohlenen Verfahren von Nanion durchgeführt. Die Zellen wurden in einem Zellhotelreservoir bei 10 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 60 U/min gelagert. Nach Beginn des Experiments wurden Zellfang, Versiegelung, Bildung ganzer Zellen, Flüssigkeitsauftrag, Aufzeichnung und Datenerfassung nacheinander und automatisch durchgeführt. Die intrazelluläre Lösung enthielt (in mM): 10 CsCl, 110 CsF, 10 NaCl, 10 EGTA und 10 HEPES (pH 7,2, Osmolarität 280 mOsm), und die extrazelluläre Lösung enthielt (in mM): 60 NMDG, 80 NaCl, 4 KCl , 10 CaCl2, 1 MgCl2, 5 Glucose und 10 HEPES (pH 7,4 mit NaOH). Ganzzellexperimente wurden bei einem Haltepotential von –100 mV und Raumtemperatur (18–22 °C) durchgeführt. Die Ströme wurden bei 20 kHz abgetastet. Für pharmakologische Tests wurden Flunarizinlösungen in verschiedenen Konzentrationen in der extrazellulären Lösung, ergänzt mit 0,3 % Rinderserumalbumin, hergestellt und gemäß einem zuvor festgelegten Plattenplan auf Verbundplatten mit 384 Vertiefungen verteilt. Diese Verteilung innerhalb der zusammengesetzten Platten konnte nicht randomisiert werden, da dies die Analysemethoden übermäßig komplex machen würde. Die Arbeitsverbindungslösung wurde in der Patch-Clamp-Aufzeichnungsvertiefung durch Zugabe von 30 bis 60 µL externer Lösung dreimal verdünnt, um die endgültige angegebene Konzentration und das Testvolumen von 90 µL zu erreichen. Für die Kontrollgruppen waren die Trägerlösungen extrazellulär und enthielten 0,3 % BSA und 0,1 % DMSO (was der DMSO-Konzentration in der 10 µM Flunarizin-Lösung ähnelte). Die Auswirkungen von Flunarizin wurden während einer 10-minütigen Anwendungszeit mit einem Einzelschrittprotokoll gemessen, das eine Haltepotentialperiode von 50 ms bis 100 mV, gefolgt von einem 400 ms langen Impuls bei –10 mV, enthielt. Dieses Einzelschrittprotokoll wurde im Abstand von 10 s wiederholt.

Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien und den vom Tierschutzausschuss der Universität Paris (CEEA 34) genehmigten Protokollen unter Einhaltung der europäischen und französischen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (2010/63/EU) unter den Referenznummern durchgeführt 01246.02 und B75-06-07. Den taiwanesischen SMA-Mäusen wurde von Geburt an täglich entweder Flunarizin (500 µg/ml, 1 µl/g) oder Vehikel (1 % DMSO in Kochsalzlösung) injiziert, wie beschrieben43. Die SMA-Mäuse haben einen FVB/NRj-Hintergrund (Janvier, Le Genest-St-Isle, Frankreich) und wurden wie beschrieben über 10 Generationen rückgekreuzt. Jedem Tier wurde eine Nummer zugewiesen. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Experimente blind für Genotyp, Behandlung sowie molekulare und zelluläre Studien durchgeführt. Für die Analysen wurde die Gruppenzuordnung offengelegt. Es wurden keine Ausschlusskriterien verwendet. In die Studie wurden sowohl Frauen als auch Männer einbezogen. Das schwere taiwanesische SMA-Modell (Smnko/ko; SMN2tg/0) und die entsprechenden heterozygoten Kontrollmäuse (Smnko/wt; SMN2tg/0) wurden im selben Wurf produziert. Basierend auf unseren vorherigen Ergebnissen43 untersuchten wir drei Mäuse pro Versuchsgruppe, um die Anzahl der verwendeten Tiere zu minimieren. Bei den vier Gruppen handelte es sich um mit Vehikel und Flunarizin behandelte Kontroll- und SMA-Modellmäuse (insgesamt 59 Mäuse). Die Mäuse wurden mit den PCR-Primern S1, S2, H1, 2B und 2F131 genotypisiert. Kurz gesagt wurde eine Multiplex-PCR-Reaktion mit 1 µl DNA (20 ng), 5 µl 5X grünem GoTaq-Flexi-Puffer, 2,5 µl 25 mM MgCl2 (2,5 mM endgültig), 1 µl 10 mM dNTPs-Gemisch (jeweils 2,5 mM dNTP, 200) durchgeführt µM final), 1,5 µl 10 µM S2 Forward Primer (0,6 µM Final), 0,75 µl 10 µM 2F Forward Primer (0,3 µM Final), 0,75 µl 10 µM S1, H1, 2B Reverse Primer (0,3 µM Final) und 0,15 µl GoTaq DNA-Polymerase (Promega). Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt: 5 Minuten bei 95 °C, dann 30 Sekunden bei 95 °C, 1 Minute bei 58 °C, 45 Sekunden bei 72 °C für 33 Zyklen und ein abschließender Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72 °C. Die PCR-Produkte S2-S1 (1150 bp), S2-H1 (950 bp) und 2F-2B (478 bp) wurden auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert. SMA-Mutanten und ihre heterozygoten Wurfgeschwister wurden durch intraperitoneale Injektionen von Pentobarbital (64 mg/kg) anästhesiert und bei P5 oder P10 enthauptet. Drei Skelettmuskeln (Soleus, Plantaris, Tibialis) wurden präpariert, eingefroren und bei –80 °C gelagert. Die Immunfluoreszenzexperimente an Muskelkryoschnitten (10 μm) wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt43. Kurz gesagt, die Schnitte wurden 20 Minuten lang in 4 % PFA in PBS fixiert, 30 Minuten lang in 20 % FCS oder 4 % BSA blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern inkubiert. Nach 1 Stunde in PBS-Tween (0,1 %) wurden die Schnitte 2 Stunden lang mit sekundären Antikörpern inkubiert. Nach dem Färben und Waschen mit Bisbenzimid (oder DAPI) wurden die Schnitte mit Fluoromount-G-Lösung fixiert. Die verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Bilder wurden mit einer ORCA Flash 2.8-Kamera (Hamamatsu Photonic) aufgenommen, die auf einem Epifluoreszenzmikroskopsystem (AxioObserver Z1, ZEISS) montiert war. Zum Erfassen und Analysieren der Bilder wurden die Softwares ZEN und ImageJ verwendet. Kurz gesagt, Regionen von Interesse (ROIs) wurden zufällig ausgewählt und mithilfe der Hellfeld-Kanalbilder mit ImageJ manuell gezeichnet. Für die Fluoreszenzintensitätsanalysen von Muskelfasern wurde zunächst der Schwellenwert angepasst, um jegliches Hintergrundsignal zu entfernen, und die mittleren Grauwerte von Cav3.2-markierten Muskelfasern wurden für Fasern entweder mit Typ I-markierten oder nicht markierten Fasern (vermutlich Typ II) gemessen ) für jede Gruppe von Mäusen.

Die Größe von AChR-Clustern in C2C12-Myotubes wurde mit ImageJ durch die Messung von AChR-Aggregaten (≥ 6 bis 10 μm) in zufällig ausgewählten 20-fach-Mikroskopfeldern (40 Felder pro Experiment, n ≥ 3 unabhängige Experimente) oder aus hundert Fasern pro bestimmt Experiment (n = 3).

Der In-situ-Proximity-Ligation-Assay (PLA) wurde wie beschrieben durchgeführt132. Kurz gesagt, C2C12-Zellen wurden wie oben fixiert und permeabilisiert. Primärantikörper (Ergänzungstabelle 1) wurden im Antikörperverdünnungsmittel (DuolinkII-Kit, Sigma-Aldrich) verdünnt und über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Negativkontrollen bestanden aus der Verwendung eines einzelnen Primärantikörpers. Die Zellen wurden zweimal 5 Minuten lang in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween gewaschen. Die PLA-Sonden (Maus-PLUS und Kaninchen-MINUS) wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nachfolgende Schritte wurden mit dem Nachweisreagenz Orange durchgeführt. Die Signale wurden als Punkte mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und mit ImageJ analysiert.

Die Gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagenz (Ambion) aus Geweben und Zellkulturen extrahiert und mit einer RQ1-RNase-freien DNase (Promega) behandelt. Ein µg RNA wurde verwendet, um cDNA mit dem miScript II RT-Kit (Qiagen) für snRNA-Analysen und Superscript III (Invitrogen) für die anderen Gene zu generieren. Die quantitative Echtzeit-PCR wurde in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführten Primer mit der SYBR Green ROX-Mischung (Thermo Scientific) auf einem Applied Biosystems 7500 Fast-System oder BioRad CFX384 durchgeführt. Die normalisierten Expressionsniveaus wurden gemäß der ΔΔCt-Methode berechnet. Die snRNA-, 5 S-, 5,8 S-, Rpl13a-, Ppia-, Gapdh-, Myh4- und Z+ Agrn-Primer und ihre Analysen wurden bereits beschrieben43. Zusätzliche Primer wurden mit den kostenlosen Primer-Design-Tools von eurofins (eurofinsgenomics.eu) entworfen und gemäß den MIQE-Richtlinien validiert.

Mindestens drei unabhängige Experimente wurden als Mittelwert ± SD oder SEM dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des nichtparametrischen Kruskal Wallis, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichs-Rangtest oder Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest oder Student t'test (GraphPad) durchgeführt. Der verwendete Test wurde in den Legenden der Abbildungen angegeben. Der signifikante Schwellenwert lag bei 5 %.

Die detaillierten Berechnungen, die während der aktuellen Studie durchgeführt und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken der Kerneinrichtung von BioMedTech Facilities INSERM US36 | CNRS UMS2009 | Université de Paris Cité für Unterstützung bei Tierversuchen, Molekularbiologie und Mikroskopie. Wir möchten Pr R Barouki, J Cartaud und F Charbonnier für die ständige Unterstützung danken. Wir danken M Nabi und PE Fontaine für die technische Hilfe während ihres Praktikums. Wir danken den Kollegen für die kritische Lektüre des Manuskripts und die großzügige Bereitstellung von Protokollen und Reagenzien.

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health and Medical Research (INSERM, Einrichtungen und Gehalt an SL), dem National Centre for Scientific Research (CNRS, Einrichtungen) und der Université Paris Cité (Einrichtungen und Gehalt an PD, BS und DS) unterstützt. Die Zuschüsse CONV-16-SMA-Lefebvre und ANR-21-CE17-0039-01 an SL stammen von SMA Europe bzw. ANR.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Perrine Delers und Delphine Sapaly.

T3S, INSERM, Universität Paris Cité, 75006, Paris, Frankreich

Perrine Delers, Delphine Sapaly, Badih Salman und Suzie Lefebvre

Das Thorax-Institut, INSERM, CNRS, Universität Nantes, 44000, Nantes, Frankreich

Stephan De Waard & Michel De Waard

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PD, DS, BS, SDW, MDW und SL führten Experimente durch. PD, DS, BS, SDW, MDW und SL führten Analysen durch. SL konzipierte das Projekt und schrieb das Manuskript. Alle Autoren kommentierten das Manuskript.

Korrespondenz mit Suzie Lefebvre.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Delers, P., Sapaly, D., Salman, B. et al. Ein Zusammenhang zwischen Agrin-Signalisierung und Cav3.2 an der neuromuskulären Verbindung bei spinaler Muskelatrophie. Sci Rep 12, 18960 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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Eingegangen: 20. Januar 2022

Angenommen: 03. November 2022

Veröffentlicht: 08. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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