Ein epigenetischer Mechanismus seit jeher

May 20, 2023

Molecular Psychiatry Band 27, Seiten 4893–4904 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Übermäßige Angst ist ein Kennzeichen von Angststörungen und eine der Hauptursachen für die Krankheitslast weltweit. Umfangreiche Belege belegen die Rolle präfrontaler Cortex-Amygdala-Schaltkreise bei der Regulierung von Furcht und Unruhe, doch die molekularen Mechanismen, die ihre Aktivität regulieren, sind nach wie vor kaum verstanden. Hier zeigen wir, dass eine Herunterregulierung der Histonmethyltransferase PRDM2 im dorsomedialen präfrontalen Kortex den Angstausdruck durch Modulation der Angstgedächtniskonsolidierung verstärkt. Wir zeigen weiterhin, dass der Abbau von Prdm2 (KD) in Neuronen, die vom dorsomedialen präfrontalen Kortex zur basolateralen Amygdala (dmPFC-BLA) projizieren, einen erhöhten Angstausdruck fördert. Prdm2 KD im dmPFC-BLA-Schaltkreis führte auch zu einer erhöhten Expression von Genen, die an der Synaptogenese beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass Prdm2 KD die Konsolidierung konditionierter Angst moduliert, indem es die synaptische Stärke an dmPFC-BLA-Projektionszielen verändert. Im Einklang mit einer verbesserten synaptischen Wirksamkeit stellten wir fest, dass dmPFC Prdm2 KD die Wahrscheinlichkeit einer glutamatergen Freisetzung in der BLA erhöhte und die Aktivität von BLA-Neuronen als Reaktion auf angstassoziierte Hinweise erhöhte. Zusammengenommen liefern unsere Ergebnisse einen neuen molekularen Mechanismus für übermäßige Angstreaktionen, wobei PRDM2 den dmPFC-BLA-Schaltkreis durch spezifische transkriptomische Veränderungen moduliert.

Normale Angst löst adaptive Reaktionen aus, die darauf abzielen, lebensbedrohlichen Ereignissen zu entkommen [1, 2]. Im Gegensatz dazu werden übermäßige Angstreaktionen maladaptiv und sind charakteristisch für angstbedingte Störungen wie die posttraumatische Belastungsstörung und mehrere Angststörungen [3]. Die Pathologie von Gedächtnisprozessen, die mit erlernter Angst einhergehen, kann zu verstärkten Verhaltensreaktionen führen, die trotz Fehlens einer relevanten Bedrohung nicht ausgelöscht werden [4]. Durch die Identifizierung der neuronalen Schaltkreise und molekularen Mechanismen, die einem übermäßigen Angstgedächtnis zugrunde liegen, können molekulare Signalwege identifiziert werden, auf die mechanistische Behandlungen abzielen können.

Untersuchungen zur Angstkonditionierung haben Gehirnstrukturen identifiziert, die an der Verarbeitung des Angstgedächtnisses beteiligt sind [5, 6]. Unter diesen ist der Amygdala-Komplex, einschließlich der zentralen Amygdala (CeA) und der basolateralen Amygdala (BLA), von entscheidender Bedeutung für die Pawlowsche Angstkonditionierung [7]. Das CeA ist an der Ausprägung konditionierter Angstreaktionen beteiligt, während das BLA als primärer Ort fungiert, an dem Assoziationen zwischen konditionierten und unbedingten Reizen gebildet und gespeichert werden [8]. Die Amygdala ist umfassend mit dem präfrontalen Kortex (PFC) verbunden, einer Gehirnregion, die für die Emotionsregulation wichtig ist [9]. Es wird angenommen, dass der PFC, einschließlich des dorsomedialen präfrontalen Kortex (dmPFC; prälimbischer und cingulärer Kortex) und des ventromedialen präfrontalen Kortex (infralimbisch), ebenfalls an der Angstgedächtnisverarbeitung beteiligt ist [10, 11]. Insbesondere wurde die Aktivierung von Projektionen vom dmPFC zum BLA mit einer Top-Down-Regulierung des Angstausdrucks in Verbindung gebracht [12,13,14,15]. Die molekularen Mechanismen, die die Modulation des dmPFC-BLA-Signalwegs bei der Verarbeitung von Angstgedächtnissen regulieren, müssen jedoch noch vollständig verstanden werden.

Zunehmende Hinweise deuten auf eine Rolle epigenetischer Mechanismen bei der Regulierung von Angstgedächtnisprozessen hin [16, 17]. Vergangene Erfahrungen, einschließlich stressiger Ereignisse, können durch Veränderungen der Genexpression zu einem „Neuprogrammierungsprozess“ führen. Es wird angenommen, dass die epigenetische Regulation ein Schlüsselmechanismus ist, der Transkription und Translation [18] erfahrungsabhängig verändert [19,20,21]. Durch epigenetische Prozesse vermittelte weitreichende Fehlregulationen der Genexpression können daher traumatische Stressbelastungen mit der Entwicklung stressbedingter Störungen in Verbindung bringen.

Wir haben zuvor herausgefunden, dass eine Herunterregulierung der Histon-Methyltransferase-PR-haltigen Domäne 2 (PRDM2) aufgrund einer Alkoholabhängigkeit in der Vorgeschichte mit erhöhten Stressreaktionen verbunden ist. PRDM2 fördert die Gen-Stummschaltung durch die Hinzufügung einer Methylgruppe an Histon H3 Lysin 9 [22]. PRDM2 ist im Gehirn stark angereichert und wird selektiv in Neuronen des dmPFC exprimiert, was auf eine Rolle dieses epigenetischen Enzyms bei der neuronalen Funktion schließen lässt [23]. Dementsprechend fanden wir heraus, dass der Prdm2-Knockdown (KD) im dmPFC den stressbedingten Rückfall in die Alkoholsucht verstärkte [23]. Eine wachsende Literatur weist auf einen Zusammenhang zwischen übermäßigem Alkoholkonsum und angstbedingten Störungen sowohl auf Verhaltens- als auch auf neuronaler Ebene hin [24,25,26,27,28]. Hier stellten wir daher die Hypothese auf, dass ein Prdm2-Mangel im dmPFC zur Entwicklung pathologischer Angst beitragen könnte, indem er Veränderungen der Genexpression in angstbezogenen Gehirnschaltkreisen fördert.

Um diese Hypothese zu testen, haben wir Prdm2 im dmPFC der Ratte ausgeschaltet und die Auswirkungen auf den Erwerb, den Ausdruck und das Aussterben konditionierter Angst untersucht. Angesichts der entscheidenden Rolle von dmPFC-Projektionen auf die BLA bei ausgelöster konditionierter Angst [12, 13, 29, 30] verwendeten wir als nächstes eine projektionsspezifische Strategie, um zu bestimmen, ob Prdm2 KD die Angst über diesen neuronalen Weg reguliert. Anschließend verwendeten wir die virale translatierende ribosomale Affinitätsreinigung (vTRAP) mit Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNAseq), um die nachgeschalteten molekularen Konsequenzen von Prdm2 KD auf schaltkreisspezifische Weise zu identifizieren. Da diese Analyse eine breite Hochregulierung von Transkripten identifizierte, die für Proteine ​​kodieren, die an der Regulierung der synaptischen Aktivität beteiligt sind, untersuchten wir schließlich die Auswirkungen von Prdm2 KD auf glutamaterge Eingaben in die BLA mithilfe von Patch-Clamp-Aufzeichnungen in Amygdala-Schnitten und maßen dabei die Aktivität von dmPFC-BLA-Neuronen Angstgedächtnistest mit In-vivo-Faserphotometrie.

Erwachsene männliche Wistar-Ratten (200–225 g, Charles River, Deutschland) wurden unter einem umgekehrten Lichtzyklus mit unbegrenztem Futter und Wasser gehalten. Die Verfahren entsprachen dem Nationalen Komitee für Tierversuche in Schweden und wurden von der örtlichen Ethikkommission für Tierpflege und -nutzung an der Universität Linköping genehmigt.

In dieser Studie wurden neun Rattengruppen verwendet (N = 268). Die Tiergruppierung wurde zufällig zugewiesen. In Experiment 1 (n = 17 durcheinander und 20 Prdm2 KD) wurden Ratten auf Erwerb, Ausdruck (nach 24 Stunden) und Aussterben des Angstgedächtnisses getestet. In Experiment 2 (durcheinander: n = 12 und Prdm2 KD n = 12) wurden Ratten eine Woche nach der Konditionierung auf die Expression des Angstgedächtnisses sowie auf Kontextgeneralisierung und Fußstoßempfindlichkeit getestet. In Experiment 3 (n = 17 durcheinander und 20 Prdm2 KD) haben wir die Wirkung von Prdm2 KD nachgebildet, die den Angstausdruck 24 Stunden nach der ausgelösten Angstkonditionierung erhöhte. Vor der Angstkonditionierung wurden die Ratten auf Angstzustände im EPM und in der Bewegungsaktivität getestet. Die Plasma-Corticosteronspiegel wurden zu Studienbeginn, nach der Konditionierung und nach dem Testen des Ausdrucks des Angstgedächtnisses gemessen. Eine Woche nach dem Angstexpressionstest wurden die Ratten eingeschläfert und das dmPFC für die Genexpressionsanalyse gesammelt. In Experiment 4 (durcheinander: n = 20 und Prdm2-KD n = 18) wurden Ratten eine Woche vor der viral vermittelten KD von Prdm2 auf den Angstreiz konditioniert und einen Monat nach der Operation auf Angstausdruck getestet. In Experiment 5 (durcheinander: n = 12 und Prdm2 KD n = 12) wurden Ratten auf die Erkennung neuartiger Objekte getestet. In Experiment 6 (verwürfelt: n = 20 und Prdm2 KD n = 19) wurden die Auswirkungen von Prdm2 KD in Neuronen, die spezifisch auf die BLA projizieren, auf die Expression des Angstgedächtnisses 24 Stunden nach der Konditionierung untersucht. In Experiment 7 (durcheinander: n = 18 Ratten; Pools mit 3 dmPFC und Prdm2 KD n = 18 Ratten; Pools mit 3 dmPFC) verwendeten wir vTRAP, um die Genexpression nach Prdm2 KD speziell in den Neuronen zu analysieren, die vom dmPFC zum BLA projizieren . In Experiment 8 (durcheinandergemischt: n = 14 Zellen von 5 Ratten und Prdm2 KD n = 15 Zellen von 6 Ratten) verwendeten wir Ex-vivo-Elektrophysiologie, um Veränderungen in der Glutamatfreisetzung an BLA-Neuronen nach Prdm2 KD zu untersuchen. Schließlich verwendeten wir in Experiment 9 (verwürfelt: n = 9 und Prdm2 KD n = 13) In-vivo-Faserphotometrie, um die Konsequenzen von Prdm2 KD in der BLA weiter zu untersuchen. Einen Überblick über die in dieser Studie durchgeführten Experimente finden Sie in der ergänzenden Abbildung S1.

Während der Angstkonditionierung wurden Ratten in einer Kammer mit spezifischen visuellen und geruchlichen Hinweisen konditioniert und sechs Versuchen mit 2 s, 1 mA Fußschocks ausgesetzt, verbunden mit einem 30 s langen neutralen Hinweiston (2,9 kHz, 80 dB; Intervall zwischen den Versuchen: 3). min; Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA). Ratten wurden auf den Ausdruck des Angstgedächtnisses in einer Kammer mit verschiedenen visuellen und Geruchshinweisen getestet und 6 × 30 s langen Hinweistönen ausgesetzt (Einzelheiten siehe ergänzende Methoden). Das Aussterben wurde untersucht, indem der Angstausdruckstest über zwei weitere Tage wiederholt wurde. Der Angstausdruck wurde als Prozentsatz der Zeit gemessen, die zwei geschulte Experimentatoren zum Zeitpunkt der Bewertung nicht kannten, während sie während des 30-Sekunden-Tons eingefroren waren. Der Ausdruck und die Auslöschung des Angstgedächtnisses werden als Durchschnitt von Block 1 (Töne 1 und 2) während der täglichen Testsitzungen dargestellt, da die Auslöschung innerhalb der Sitzung beobachtet werden kann.

Objekte wurden individuell angefertigt und interaktiv (kletterbar) gemacht, um die Erkundungszeit und den Gedächtniserwerb zu verlängern, da die Erkennung neuartiger Objekte normalerweise zur Untersuchung des Kurzzeitgedächtnisses verwendet wird (31) (ergänzende Abbildung S3). Den Ratten wurde 10 Minuten Zeit gegeben, sich mit zwei Kopien von Objekt A oder Objekt B vertraut zu machen. Am folgenden Tag wurden sie 5 Minuten lang auf die Erkennung neuartiger Objekte getestet, indem sie eines der bekannten Objekte durch ein neues ersetzten. Die Daten werden als Erkennungsindex dargestellt, definiert als: Zeit, die für die Erkundung eines neuen Objekts aufgewendet wurde/(Zeit, die für die Erkundung eines neuen + vertrauten Objekts aufgewendet wurde).

Das basale angstähnliche Verhalten wurde mithilfe des Elevated-Plus-Labyrinth-Paradigmas (EPM) wie zuvor beschrieben gemessen [32, 33]. Die Daten werden als % Zeit im offenen Arm dargestellt, d. h. Zeit im offenen Arm/(Zeit im offenen Arm + Zeit im geschlossenen Arm) *100.

Die Bewegungsaktivität wurde 30 Minuten lang unter Umgebungslicht (190–210 Lux) in schallgedämpften Kammern (43 × 43 cm) getestet, die mit einem Infrarotstrahl-Erkennungssystem (Med Associates Inc.) ausgestattet waren. Die Daten werden als kumulierte zurückgelegte Distanz in 5-Minuten-Intervallen dargestellt.

Die Schwellenwerte für die Fußstoßempfindlichkeit wurden in Boxen von Med Associates getestet. Ratten wurden 0,5 s langen Fußstößen in Schritten von 0,1 mA ausgesetzt, beginnend mit 0,1 mA, und das Zurückziehen von 1, 2 und 4 Pfoten wurde von einem verblindeten Beobachter bewertet.

Ratten erhielten bilaterale Infusionen in das dmPFC (0,25 µl/Infusion; Rate: 0,1 µl/min; anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34]) eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das enthielt eine kurze Haarnadel-RNA, die auf Prdm2 abzielt (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; Titer: 5,6E13 GC/ml; UPenn Core Facility, Philadelphia, PA) oder eine durcheinandergemischte Kontrolle (AAV9.HI.shR. luc.CMV.ZsGreen.SV40; Titer: 9,2E13 GC/ml; UPenn Core Facility, PA).

Ratten erhielten bilaterale Infusionen in das dmPFC (0,25 µl/Injektion; Rate: 0,1 µl/min; Koordinaten: anteroposterior: +3 mm, mediolateral: ±0,6 mm, dorsoventral: −3,5 mm [34] eines AAV, das einen Cre-abhängigen enthielt microRNA, die auf Prdm2 abzielt (AAV9.hSyn.DIO.-mcherry.miR.Prdm2.WPRE; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; Titer: 3,24E13 GC/ml; UPenn Core Facility, PA) oder eine durcheinandergemischte Kontrolle (AAV9.HI.shR.luc.CMV. ZsGreen.SV40). Ratten erhielten außerdem bilaterale Infusionen eines retrograd transportierten AAV, das Cre kodiert (0,5 µl/Infusion; Rate: 0,1 µl/min; AAV-retro2-hSyn1-EGFP_iCre-WPRE-hGHp(A); Titer: 7,8 × 10E12 GC/ml; Addgene, Watertown, MA) in die BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm [34]).

Ratten erhielten bilaterale Infusionen in den dmPFC eines AAV-Vektors, der eine shRNA enthielt, die auf Prdm2 abzielte, oder eine durcheinandergemischte Kontrolle, wie oben beschrieben. Ratten erhielten außerdem eine einseitige Infusion eines AAV, das GcaMP6s kodiert (0,5 µl/Infusion; Rate: 0,1 µl/min; AAV9.CaMKII.GcaMP6s.WPRE.SV40; Titer: 2,1E13 GC/ml; Addgene, Watertown, MA) in die BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm). Nach den Vektorinfusionen wurde eine 0,66 NA Borosilikatfaser mit einem Kern von 400 µm, befestigt an einer Titan-M3-Buchse (Doric Lenses, Quebec City, Kanada), dorsal zur BLA implantiert (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,5 mm). Der Behälter wurde mit einer Kombination aus Schädelschrauben, Sekundenkleber und schwarzem Ortho-Jet-Zahnkunststoff (Riss-Dental, Hanau, Deutschland) am Schädel befestigt.

Ratten wurden daran gewöhnt, vor der Angstkonditionierungssitzung mehrere Tage lang an ein Glasfaser-Patchkabel angeschlossen zu sein. Der Cue-Ausdruck des Angstgedächtnisses wurde 24 Stunden nach der Konditionierung erneut beurteilt und die von GCaMP6s emittierte Fluoreszenz als Proxy für die Kalziumaktivität wurde während der gesamten Sitzung unter Verwendung zuvor beschriebener Methoden [35,36,37] mit geringfügigen Modifikationen gemessen. Kurz gesagt, GCaMP6s wurden bei zwei Wellenlängen (465 nm, kalziumabhängiges Signal und isosbestische Kontrolle bei 405 nm) durch Licht angeregt, das von zwei sinusförmig modulierten LEDs (330 Hz und 210 Hz für 465 bzw. 405 nm) stammte und von dichroitischen Signalen reflektiert wurde Spiegel (Fluoreszenz-Miniwürfel mit 4 Anschlüssen; Dorische Linsen) und in ein 400 μm 0,57 NA-Glasfaser-Patchkabel eingekoppelt, das wiederum mit dem Faserimplantat verbunden war. Die Lichtintensität für beide Wellenlängen wurde an der Spitze des Patchkabels auf 10–15 µW eingestellt. Die von beiden Kanälen ausgesendeten Signale kehrten dann über dieselbe optische Faser zurück und wurden mit einem in den Fluoreszenz-Miniwürfel eingebauten Fotosensor bei 6,1 kHz erfasst, demoduliert (Lock-in-Verstärkung) und bei 1017,3 kHz digitalisiert und von einem Echtzeit-Signalprozessor aufgezeichnet ( RZ5D; Tucker Davis Technologies, Alachua, FL, USA). Verhaltenszeitstempel des Beginns und Versatzes des Tons (CS+) wurden durch TTL-Eingabe in den Echtzeit-Signalprozessor aus den Verhaltenskammern von Med-Associates digitalisiert.

Für die weitere Offline-Analyse wurden nur Ratten mit korrekter Faserplatzierung und GcaMP-Expression direkt unter der Faserspitze (Post-Mortem-Inspektion) sowie beobachtbarer Kalziumaktivität (visuelle Inspektion der gesamten Sitzungsspuren) einbezogen. Diese Analyse wurde mithilfe einer benutzerdefinierten grafischen Benutzeroberfläche (GUI) durchgeführt, die auf Python-Skripten basiert. Die rohen 465-nm- und 405-nm-Signale wurden zunächst herunterabgetastet (50-fach) und geglättet (Nullphasen-Gleitender-Mittelwert-Filter mit Fenstergröße 10 Proben). Als nächstes wurden ereignisabhängige Histogramme Versuch für Versuch mit einem Zeitfenster von –30 s und 40 s rund um den Tonbeginn erstellt. Abschließend wurden die Datentrends bereinigt, um Bewegungs-, Fotobleich- und Faserbiegeartefakte zu entfernen. Pro Versuch wurden die Signale beider Kanäle unabhängig voneinander mithilfe einer linearen Polynomregression an eine Zeitkurve angepasst, um ein vorhergesagtes Signal für beide Kanäle zu generieren. Das Subtrahieren des vorhergesagten Signals vom gemessenen Rohsignal ergab einen ∆F für jeden Kanal, der anschließend durch Division durch das vorhergesagte Signal des Kanals normalisiert wurde, was zu ∆F/F führte. Anschließend wurden die trendbereinigten Signale der 465-nm- und 405-nm-Kanäle voneinander subtrahiert, um ein normalisiertes Calcium-abhängiges GCaMP-Fluoreszenzsignal (% ∆F/F) zu berechnen.

Um die molekularen Mechanismen stromabwärts von Prdm2 KD zu identifizieren, insbesondere in Neuronen, die vom dmPFC zum BLA projizieren, verwendeten wir die vTRAP-Methode der viralen translatierenden ribosomalen Reinigung. Bei dieser Methode wird ein Konstrukt, das für eine mit einem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (EGFP) markierte ribosomale Untereinheit (L10a) kodiert, selektiv in interessierenden neuronalen Populationen exprimiert, beispielsweise unter Verwendung des Cre/lox-Systems. Die EGFP-markierte Untereinheit wird dann in die Ribosomen transfizierter Zellen eingebaut. Diese markierten Ribosomen können dann zusammen mit der daran gebundenen translatierenden RNA durch Immunpräzipitation isoliert und einer Genexpressionsanalyse mithilfe von RNAseq unterzogen werden. Der Hauptvorteil der Verwendung von TRAP besteht darin, dass sich die mit den Ribosomen verbundene mRNA im Translationsprozess befindet. Die Translation erfolgt, nachdem viele der regulatorischen Ereignisse der Genexpression bereits stattgefunden haben, und die Translation der mRNA wird daher enger mit den Proteinspiegeln korrelieren [38].

Ratten erhielten bilaterale Infusionen im dmPFC eines viralen Cocktails mit 1:4 Teilen eines AAV9, das eine auf Prdm2 abzielende shRNA oder eine durcheinandergemischte Kontrolle enthielt, und 3:4 Teilen eines AAV5, das eine Cre-abhängige, EGFP-markierte ribosomale Untereinheit kodierte ( EGFP-L10a; AAV5-FLEX-EGFPL10a; Titer: 7 × 10¹² vg/ml). Ratten erhielten außerdem bilaterale Infusionen des für AAV2-retro kodierenden Cre (0,5 µl/Infusion; AAV-retro/2-hSyn1-mCherry_iCre-WPRE-hGHp(A); Titer: 5,0 × 10E12 vg/ml) in die BLA (anteroposterior: −2,4 mm, mediolateral: ±5 mm, dorsoventral: −8,4 mm) [34]. Die Isolierung der dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (39). Kurz gesagt, dmPFC wurde präpariert und die Proben wurden in Lysepuffer (10 mM HEPES-KOH; pH 7,4, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 100 mg/ml Cycloheximid, RNasin; Promega und SUPERase-In™) homogenisiert , Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; RNase-Inhibitoren und Complete-EDTA-freie Proteaseinhibitoren, Roche, Basel, Schweiz). Die Proben wurden drei Zentrifugationsschritten unterzogen, in denen nach der ersten bzw. zweiten Zentrifugation 10 % NP-40 und 300 mM DHPC zum Überstand gegeben wurden. Die Polysomen-Immunpräzipitation wurde unter Verwendung monoklonaler Anti-EGFP-Antikörper (Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility; Klonnamen: Htz-GFP-19F7 und Htz-GFP-19C8) durchgeführt, die an mit biotinyliertem Protein L (Pierce; Thermo Fisher Scientific) beschichtetes Streptavidin gebunden waren -konjugierte Magnetkügelchen (Life Technologies). Anschließend wurde die RNA mit dem Absolutely RNA Nanoprep Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gereinigt. Die RNA-Konzentration und -Integrität wurden mit dem Bioanalyzer RNA 6000 Pico-Assay (RNA-Konzentration: ∼990 pg/µl, RIN 9,5–10) gemessen und zur RNAseq an die National Genomics Infrastructure (NGI, Schweden) gesendet.

Die Proben wurden auf NovaSeq6000 (NovaSeq Control Software 1.7.0/RTA v3.4.4; Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) mit einem 151nt(Read1)-10nt(Index1)-10nt(Index2)-151nt(Read2) sequenziert ) Einrichtung mit dem „NovaSeqXp“-Workflow in der Flusszelle im „S4“-Modus. Die Konvertierung von Bcl zu FastQ wurde mit bcl2fastq_v2.20.0.422 aus der CASAVA-Software-Suite durchgeführt. Die verwendete Qualitätsskala ist Illumina 1,8.

Die Qualität der Sequenzierungsdaten wurde mithilfe von FastQC und Preseq bewertet. Hochwertiges Trimmen und Trimmen zum Entfernen von Adaptersequenzen wurde mit TrimGalore durchgeführt! und Cutadapt im Paired-End-Trimmmodus und mit einem hochwertigen Phred-Score-Cutoff von 20. Die STAR-Aligner-Software wurde verwendet, um die getrimmten Sequenzierungsablesungen an das Ensembl-Referenzrattengenom Rnor_6.0 mit den zugehörigen Annotationsdaten anzupassen. Die Ausrichtungsqualität wurde mithilfe von Qualimap bewertet und die Zuordnung ausgerichteter Lesevorgänge zu genomischen Merkmalen wurde mit featureCounts durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit MultiQC zusammengefasst.

Nachgelagerte Analysen wurden mit der Programmiersprache R und Rstudio durchgeführt. Die Varianz- und Bibliotheksgrößennormalisierung der Zähldaten erfolgte durch Anwendung einer Varianzstabilisierungstransformation (VST) vor der Hauptkomponentenanalyse. Die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit dem R-Paket DESeq2 durchgeführt. Als Grenzwert für die statistische Signifikanz wurde ein an die Falscherkennungsrate angepasster p-Wert unter 0,05 verwendet.

Wir haben die Software Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Agilent Technologies) verwendet, um miteinander verbundene Gene in einem Signalweg zu identifizieren. Die Datenbank, die IPA unterstützt, enthält über 7 Millionen Ergebnisse und wird kontinuierlich aktualisiert. Der von IPA verwendete Algorithmus ermöglicht es uns, Gene zu identifizieren, die in einem bestimmten Signalweg angereichert sind. Es liefert auch Vorhersagen zur Signalwegaktivierung/-hemmung und zeigt somit an, ob die identifizierten Genexpressionsänderungen zur Aktivierung oder Hemmung eines bestimmten Signalwegs führen können. Um die zugrunde liegenden Muster unserer RNA-seq-Daten weiter zu untersuchen, führten wir eine gewichtete Gen-Koexpressionsnetzwerkanalyse (WGCNA) unter Verwendung des WGCNA R-Pakets mit Standardparametern durch. Durch diesen Ansatz wurde ein gewichtetes Gen-Koexpressionsnetzwerk basierend auf VST-normalisierten Lesezahldaten aufgebaut. Module miteinander verbundener, stark koexprimierter Gene wurden mit einer Mindestmodulgröße von 30 Genen identifiziert und Module mit ähnlichen Expressionsprofilen (Korrelation > 0,75) zusammengeführt. Die Analyse der differentiellen Expression wurde durchgeführt, indem mithilfe des Limma-Pakets in R ein lineares Modell an die Daten angepasst und die Expressionsprofile jedes Moduls zwischen Prdm2 KD und gemischten Kontrollproben verglichen wurden. Modulgene wurden auf der Grundlage von Daten aus der Gene Ontology-Wissensdatenbank unter Verwendung des R-Pakets „clusterProfiler“ auf funktionelle Anreicherung analysiert.

Nach Abschluss der Experimente 3 und 6 wurden die Gehirne entnommen und schockgefroren. 12-µm-Gehirnschnitte wurden auf dmPFC-Niveau gesammelt und bis zur Verwendung bei –80 °C aufbewahrt. Die In-situ-Hybridisierung wurde gemäß dem Benutzerhandbuch des RNAscope Fluorescent Multiplex Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) und wie zuvor beschrieben durchgeführt (23). Die Prdm2-Sonde (Zugangsnummer NM_001077648.1) wurde von Advanced Cell Diagnostics (Newark, CA, USA) erworben. Kurz gesagt, die Schnitte wurden bei 40 °C mit einer Reihe von 4 Sonden inkubiert, die darauf ausgelegt waren, Transkripte bis zu einem Punkt zu amplifizieren, an dem sie einzeln quantifiziert werden können. Dazu gehören die Prdm2-Zielsonde, eine Vorverstärkersonde, eine Verstärkersonde und die fluoreszierend markierte Sonde Atto 550 (rot) im C1-Kanal zur Visualisierung von Prdm2-Transkripten. Mikrofotografien zur Quantifizierung wurden mit einem konfokalen Mikroskop bei 20-facher Vergrößerung (Zeiss LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Deutschland) aufgenommen. Die Prdm2-mRNA-Spiegel wurden als Gesamtpixel des Fluoreszenzsignals bewertet. Wir gingen davon aus, dass jedes Pixel ein einzelnes mRNA-Molekül darstellt. Die Gesamtzahl der Prdm2-positiven Pixel wurde nach automatischer Anpassung des Schwellenwerts mithilfe der ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) gemessen [40].

Die Gehirne wurden schnell entnommen und in eine eiskalte Schneidlösung auf N-Methyl-D-Glucamin (NMDG)-Basis gelegt, die (in mM) enthielt: 92 NMDG, 20 HEPES, 25 Glucose, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 Natriumascorbat, 3 Natriumpyruvat, 2 Thioharnstoff, 10 MgSO4 und 0,5 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Akute koronale Hirnschnitte (250 μm dick), die entweder PFC oder BLA enthielten, wurden mit einem Vibratom (Leica VT1200 S, Leica Biosystems Inc., IL, USA) erhalten. Nach dem Schneiden wurden die Scheiben in eine Aufbewahrungskammer überführt, die mit einer vorgewärmten (∼34 °C) Aufbewahrungslösung gefüllt war, die (in mM) enthielt: 92 NaCl, 20 HEPES, 25 Glucose, 30 NaHCO3, 1,2 NaH2PO4, 2,5 KCl, 5 Natrium Ascorbat, 3 Natriumpyruvat, 2 Thioharnstoff, 1 MgSO4 und 2 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Anschließend wurde die Haltelösung bei Raumtemperatur gehalten und nach >1 Stunde Erholungszeit wurde eine einzelne Scheibe in die Aufzeichnungskammer überführt und kontinuierlich mit einer Flussrate von ca. 2,0 ml/min mit erwärmtem (ca. 30–32 °C) Wasser perfundiert. Künstliche Liquor cerebrospinalis (aCSF, in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 11 Glucose, 26 NaHCO3, 2,4 CaCl2 (310 mOsm, pH 7,4). Alle Lösungen waren mit 95 % O2 und 5 % CO2 gesättigt. Spontane EPSCs (sEPSCs) wurden mit Borosilikatglas-Patchpipetten (2,5–3,0 MΩ; Harvard Apparatus, MA, USA) aufgezeichnet, die (in mM) enthielten: 135 K-Gluconat, 20 KCl, 10 HEPES, 0,1 EGTA, 2 MgCl2, 2 Mg -ATP, 0,3 Na-GTP (290 mOsm, pH-Wert mit KOH auf 7,3 eingestellt). Hervorgerufene EPSCs (eEPSCs) wurden unter Verwendung einer Cs-basierten intrazellulären Lösung aufgezeichnet, die (in mM) enthielt: 140 Cs-Methansulfonat, 5 NaCl, 1 MgCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 2 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP, 5 QX- 314 Chlorid (290 mOsm, pH-Wert mit CsOH auf 7,3 eingestellt). Das Paarimpulsverhältnis wurde als Verhältnis zwischen eEPSC2 und eEPSC1 analysiert (0,05 Hz, 50 ms Zwischenimpulsintervall, 50 μs Reizdauer). Das inverse Quadrat des Variationskoeffizienten (1/CV2) wurde als Verhältnis zwischen dem Quadrat der mittleren Amplitude und der Varianz (μ2/σ2) von 20 aufeinanderfolgenden eEPSCs (0,05 Hz) gemessen. Das Varianz-zu-Mittelwert-Verhältnis (VMR) wurde als Varianz dividiert durch die mittlere Amplitude (σ2/μ) von 20 aufeinanderfolgenden eEPSCs (0,05 Hz) gemessen. Das AMPA/NMDA-Verhältnis wurde gemessen, indem die Spitzenamplitude des AMPAR-vermittelten Stroms (gemessen bei –70 mV) durch die NMDAR-abhängige Komponente (gemessen bei +40 mV, 50 ms nach dem Einsetzen des eEPSC) in Abwesenheit dividiert wurde glutamaterge Rezeptorblocker. Alle Aufnahmen wurden im Spannungsklemmenmodus mit einem Haltepotential von –70 mV und in Gegenwart der GABAR-Blocker Picrotoxin (100 μM) und CGP55845 (2 μM) durchgeführt. Das geschätzte Verbindungspotential betrug 11 mV für K-Gluc und 8,5 mV für Cs-basierte intrazelluläre Lösung und wurde während der elektrophysiologischen Aufzeichnungen nicht kompensiert. Die Ergebnisse wurden mit Mann-Whitney-Tests analysiert und alle Reagenzien und Medikamente wurden von Thermo Fisher Scientific bezogen.

Verhaltens- und Faserphotometriedaten wurden mit Statistica 13.0 (TIBCO Software, Palo Alto, CA, USA) analysiert und Diagramme mit Prism 9.1.2 (Graphpad Software LLC., San Diego, CA, USA) erstellt. Die Normalität wurde mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests überprüft. Die Daten zur Peak-Kalzium-Reaktion mussten vor der Analyse logarithmisch transformiert werden, um der Normalverteilung zu entsprechen. Die Homogenität der Varianz wurde mithilfe des Levene-Tests bewertet. Die Daten verstießen nicht gegen die Annahme der Homogenität und wurden daher je nach Bedarf mit einem ungepaarten Student-T-Test, einer einfaktoriellen ANOVA oder einer zweifaktoriellen ANOVA mit wiederholten Messungen analysiert. Das akzeptierte Signifikanzniveau für alle Tests war p < 0,05. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten und die elektrophysiologische Aufzeichnung sind oben beschrieben. Die Probengröße für jedes Experiment basierte auf der Variation, die in früheren, ähnlichen Experimenten und Pilotstudien beobachtet wurde. Ratten mit Virusinjektion/Lichtwellenleiter, die sich außerhalb des Zielgebiets befanden, wurden aus der Studie ausgeschlossen.

Um zu beurteilen, ob Prdm2 KD Angstgedächtnisprozesse beeinflusst, erhielten Ratten bilaterale Mikroinfusionen eines AAV, das eine auf Prdm2 abzielende shRNA oder eine durcheinandergemischte shRNA im dmPFC exprimierte (Abb. 1A). Prdm2 KD führte zu einer um etwa 50 % verminderten Expression von Prdm2 im dmPFC (Abb. 1C, D; Einweg-ANOVA: F(1,17) < 0,001, verschlüsselt: n = 9 und Prdm2 KD n = 10). Ratten wurden einen Monat nach der Virusinfusion auf den Erwerb, die Expression und das Aussterben von Angstgedächtnissen getestet (Abb. 1E). Wir fanden heraus, dass Prdm2 KD im dmPFC den Erwerb des Angstgedächtnisses nicht beeinflusste (Abb. 1F), aber den Ausdruck des Angstgedächtnisses 24 Stunden nach der Konditionierungssitzung signifikant steigerte, gemessen an einer verstärkten, durch Töne hervorgerufenen Einfrierreaktion (Abb. 2G, H; Einweg-ANOVA: F(1,35) = 11,55; p = 0,002; verwürfelt: n = 17 und Prdm2 KD n = 20).

Ein repräsentativer Kachelscan der Virusinjektionsstelle und -verbreitung. B, C Repräsentative Bilder zur RNAscope-Quantifizierung. D KD von Prdm2 induziert eine signifikante Herunterregulierung von Prdm2 im dmPFC. E Experimenteller Zeitplan: Am ersten Tag erhielten die Ratten eine bilaterale Infusion eines AAV9, das entweder eine shRNA-Prdm2 oder eine durcheinandergemischte Kontrolle enthielt. Anschließend wurden die Ratten auf Angsterwerb (Tag 31), Angstausdruck (Tag 32) und Angstaussterben (Tag 33–34) getestet. F KD von Prdm2 hatte keinen Einfluss auf den Erwerb des Angstgedächtnisses (der Erwerb des Angstgedächtnisses wird als Durchschnitt der Töne 2–6 während der Konditionierungssitzung dargestellt), aber G erhöhte den Angstausdruck 24 Stunden nach der Konditionierung signifikant (angezeigt durch % Einfrieren ±). SEM; N = 17–20/Gruppe). H Durchschnitt der ersten 2 Töne aus dem Angstausdruckstest. I Prdm2 KD hatte keinen Einfluss auf die Aussterberate, was daran zu erkennen ist, dass die Wechselwirkung für Zeit x Gruppe nicht signifikant war (dh ähnliche Steigungen). J In einer separaten Charge (N = 12/Gruppe) wurde festgestellt, dass Prdm2 KD auch 1 Woche nach der Konditionierung den Angstausdruck steigerte. K Als Prdm2 eine Woche nach dem Erwerb des Angstgedächtnisses niedergeschlagen wurde (N = 18–20/Gruppe), wurde keine Auswirkung auf den einen Monat später gemessenen Angstausdruck beobachtet. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001.

Prdm2 KD hat keinen Einfluss auf die Schockempfindlichkeit (A), die Bewegungsaktivität (B), die Erkennung neuartiger Objekte (C) und die Grundangst (D).

Als nächstes wurde die Gedächtnisauslöschung beurteilt, indem die Tiere 48 Stunden und 72 Stunden nach der Konditionierungssitzung erneut dem Expressionstest ausgesetzt wurden. Die Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen zeigte einen signifikanten Einfluss der Zeit (F(2,70) = 64,2; P < 0,001), was auf eine robuste Extinktion hinweist, und einen signifikanten Effekt der Gruppe auf die durch den Hinweis hervorgerufene Einfrierreaktion (Abb. 1I; F (1,70) = 9,64; p = 0,003). Die Steigungen der Extinktionsfunktionen waren jedoch parallel, was sich in einer nicht signifikanten Zeit-Gruppen-Wechselwirkung widerspiegelte (F(2,70) = 1,58; p = 0,21). Somit wurde die Aussterberate durch Prdm2 KD nicht verändert. Obwohl die Aussterberate nicht beeinträchtigt wurde, wurde bei Ratten mit dmPFC Prdm2 KD im Vergleich zu durcheinandergemischten Kontrollen auch nach 3 Tagen Angstauslöschungssitzungen ein erhöhter Angstausdruck beobachtet (F(1,35) = 4,10; P = 0,05). Dies deutet auf eine anhaltende Wirkung von Prdm2 KD auf den Ausdruck des Angstgedächtnisses hin. Anschließend testeten wir den Ausdruck des Angstgedächtnisses zu einem späteren Zeitpunkt, eine Woche nach der Erfassung, um die Langzeitwirkung von Prdm2 KD zu beurteilen. Wir fanden heraus, dass Prdm2 KD den Prozentsatz der Zeit, die mit dem Einfrieren verbracht wurde, auch zu diesem Zeitpunkt signifikant erhöhte (Abb. 1J; einfache ANOVA: F(1,22) = 5,11; p < 0,05; durcheinander: n = 12 und Prdm2 KD n = 12), was eine dauerhafte Wirkung von Prdm2 KD zeigt. Zusammengenommen belegen diese Daten eine Hochregulierung der konditionierten Angstreaktionen nach Prdm2 KD, mit einem zeitlichen Verlauf, der mit einer epigenetischen Neuprogrammierung des Transkriptoms übereinstimmt.

Prdm2 KD erhöhte gezielt den Angstausdruck, ohne den Angsterwerb zu beeinflussen (Abb. 1), was darauf hindeutet, dass PRDM2 die assoziativen Lernprozesse, die den unbedingten Reiz (d. h. Fußschock) mit dem konditionierten Reiz (d. h. Ton) verbinden, nicht beeinflusst. Prdm2 KD kann den Angstausdruck verbessern, indem es Prozesse moduliert, die an der Gedächtniskonsolidierung oder dem Erinnerungsabruf beteiligt sind. Um diese Frage zu beantworten, wurde das AAV, das shRNA gegen Prdm2 enthielt, eine Woche nach der Angstkonditionierung in den dmPFC infundiert. Angesichts der Zeit, die die shRNA benötigt, um die Prdm2-Expression stabil zu reduzieren, waren die meisten Konsolidierungsprozesse zu diesem Zeitpunkt bereits im dmPFC gebildet worden [13, 41]. Unter diesen Bedingungen beobachteten wir keine Unterschiede zwischen Prdm2-KD-Ratten und durcheinandergemischten Kontrollen (Abb. 1K; durcheinandergemischt: n = 20 und Prdm2-KD n = 18), was darauf hindeutet, dass Prdm2-KD im dmPFC zu einem anhaltenden Anstieg des Angstausdrucks über Effekte führt Es geht um die Konsolidierung des Gedächtnisses und nicht um das Abrufen des Gedächtnisses.

Wir beobachteten keine Auswirkungen von Prdm2 KD auf die Stoßempfindlichkeit des Fußes und die Bewegungsaktivität, was auf eine spezifische Wirkung von Prdm2 KD auf den Angstausdruck hindeutet (Abb. 2A, B; durcheinander: n = 20 und Prdm2 KD n = 20). Wir haben auch getestet, ob Prdm2 KD andere Arten des Gedächtnisses beeinflusst, indem wir eine neuartige Objekterkennungsaufgabe durchgeführt haben, und keine Auswirkung von Prdm2 KD auf den Erkennungsindex festgestellt (Abb. 2C; verschlüsselt: n = 12 und Prdm2 KD n = 12). Die Wirkung von Prdm2 KD auf angstähnliches Verhalten wurde ebenfalls getestet. Bei Prdm2-KD-Ratten beobachteten wir einen Trend zu einem verringerten Prozentsatz der offenen Armzeit. Dies war jedoch nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass Prdm2 das angeborene angstähnliche Verhalten nicht stark beeinflusst (Abb. 2D; verschlüsselt: n = 20 und Prdm2 KD n = 20).

dmPFC-BLA-Projektionen sind an der Vermittlung des Angstausdrucks beteiligt [12, 13]. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass Prdm2 KD den Ausdruck von Angst steigern könnte, indem es die Aktivität von dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen moduliert. Um diese Hypothese anzugehen, untersuchten wir zunächst, ob eine selektive KD von Prdm2 in dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen ausreicht, um den Angstausdruck zu erhöhen. Wir verwendeten einen Dual-Vektor-Ansatz, bei dem ein retrograd transportiertes AAV-kodierendes Cre in die BLA injiziert wurde und eine AAV-kodierende Cre-abhängige Prdm2-microRNA in den dmPFC infundiert wurde (Abb. 3A, B) [42]. Ähnlich wie wir es bei einem Prdm2-KD in dmPFC beobachteten, der nicht projektionsspezifisch war, hatte Prdm2-KD in dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen keinen Einfluss auf den Erwerb konditionierter Angst (Abb. 3C), erhöhte jedoch den Ausdruck des Angstgedächtnisses 24 Stunden danach signifikant Erfassung (Abb. 3D; einfache ANOVA: F(1,37) = 4,56; p < 0,05; verschlüsselt: n = 20 und Prdm2 KD n = 19). Es wurden keine Unterschiede in der Bewegungsaktivität oder im angstähnlichen Verhalten in Prdm2 KD dmPFC-BLA-Gruppen im Vergleich zu durcheinandergemischten Kontrollen festgestellt (ergänzende Abbildung 4A bzw. B). In der dmPFC-BLA Prdm2 KD-Gruppe wurde ein Trend zu einem geringeren Prozentsatz der im offenen Arm verbrachten Zeit beobachtet, ähnlich dem, der in der dmPFC Prdm2 KD-Gruppe beobachtet wurde.

Ein Schema, das den dualen viralen Ansatz darstellt. B-Kachelscans, die die Virusausbreitung im dmPFC und BLA zeigen, und repräsentative Bilder, die dmPFC-Neuronen zeigen, die mit AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS grün (grün) infiziert sind, dmPFC-Neuronen, die mit rAAV2-Retro-Cre-mCherry infiziert sind (rot), und dmPFC-Neuronen Koinfektion von AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS grün und rAAV2 retro Cre-mCherry (gelb; Maßstabsbalken, 50 µm). C KD von Prdm2 in Neuronen, die vom dmPFC zum BLA projizieren, hatte keinen Einfluss auf den Angsterwerb, gemessen als % Einfrieren ± SEM. D Prdm2 KD in dmPFC-BLA reichte aus, um den Angstausdruck 24 Stunden nach der Konditionierung zu erhöhen (N = 19–20). *p < 0,05. BLA basolaterale Amygdala, dmPFC dorsomedialer präfrontaler Kortex.

Um die nachgeschalteten molekularen Ziele zu identifizieren, über die Prdm2 KD die durch dmPFC-BLA erhöhte Angstgedächtniskonsolidierung reguliert, sequenzierten wir das Translatom von dmPFC-BLA-Neuronen mithilfe einer vTRAP-Strategie (Abb. 4A, B; durcheinander: n = 18 Ratten; Pools von 3). dmPFC und Prdm2 KD n = 18 Ratten; Pools von 3 dmPFC) [39].

Prdm2 KD in dmPFC-BLA-Neuronen reguliert Gene, die an der Synaptogenese beteiligt sind. Ein Schema, das den dreifach viralen Ansatz darstellt, der für das vTRAP-Experiment verwendet wird. B-Kachelscans zeigen die Virusausbreitung in dmPFC und BLA sowie in dmPFC-Neuronen, die mit AAV5-FLEX-EGFPL10a infizierte Zellen (grün), mit rAAV2 retro Cre-mCherry infizierte Zellen (rot) und Zellen mit einer Koinfektion von AAV5 zeigen -FLEX-EGFPL10a und rAAV2 Retro Cre-mCherry (gelb). C Hauptkomponentenanalyse, die die Trennung von Prdm2-KD-Proben und gemischter Kontrolle in verschiedene Cluster zeigt. D Volcano Plot, das die am stärksten veränderten Gene nach Prdm2 KD veranschaulicht. E Hierarchisches Cluster-Dendrogramm, das miteinander verbundene, stark koexprimierte Gene gruppiert. Farbkarten unter dem Dendrogramm entsprechen Modulen koexprimierter Gene. Obere Farbkarte: zunächst identifizierte Module. Untere Farbkarte: Module nach dem Zusammenführen von Modulen mit ähnlichen Ausdrucksprofilen. F Differentielle Expressionsanalyse für jedes Koexpressionsmodul, Vergleich von Prdm2 KD mit der verschlüsselten Kontrolle. Die rote horizontale gestrichelte Linie bezeichnet ein Signifikanzniveau des FDR-korrigierten p-Werts von 0,05. G Boxplot zum Vergleich des Genexpressionsprofils des Moduls „MEblue“ zwischen Bedingungen. KD: Prdm2 KD, SCR: Scramble-Steuerung. Statistischer Test: Zweiseitiger ungepaarter t-Test. H Genontologie-Anreicherung für Gene im Modul „MEblue“. I Gennetzwerkanalyse durchgeführt mit IPA. Prdm2 KD erhöht die Expression von Genen, die für die Cadherin-, Neurexin/Neuroligin- und Ephrin/Ephrin-Rezeptorfamilie sowie für Proteine, die zum SNARE-Komplex gehören, kodieren. J Differenzielle Expression und Signifikanzniveau für ausgewählte Synaptogenese-bezogene Gene. Die vertikale gestrichelte Linie im Balkendiagramm bezeichnet ein Signifikanzniveau des FDR-korrigierten p-Werts von 0,05. BLA basolaterale Amygdala, dmPFC dorsomedialer präfrontaler Kortex.

Wir fanden heraus, dass Prdm2 KD ausreichte, um das Translationsprofil der dmPFC-BLA-Neuronen zu verändern (Abb. 4C, D). Mit vTRAP-RNAseq sequenzierten wir 22.091 Gene und stellten fest, dass Prdm2 KD die Expression von 3603 davon modulierte (Ergänzungstabelle 1: 1877 hochreguliert und 1726 herunterreguliert). Wie erwartet verringerte Prdm2 KD die Expression von Prdm2 (Ergänzungstabelle 1: adj p = 3,33E-23) in den dmPFC-BLA-Neuronen. Die WCNA-Analyse identifizierte insgesamt 32 Koexpressionsmodule hochkorrelierter Gene, die weiter zu 28 unterschiedlichen Modulen zusammengeführt wurden (Abb. 4E). Unter diesen 28 Modulen zeigte das größte mit dem Namen „MEblue“ einen signifikanten Unterschied in der Expression zwischen Prdm2 KD und der verschlüsselten Kontrolle (Abb. 4F, G). Dieses Modul zeigte eine Anreicherung biologischer Prozesse wie der Synapsenorganisation und der Regulierung des Membranpotentials (Abb. 4H). Wir haben IPA auch verwendet, um Gene basierend auf ihrer Funktion zu gruppieren. Wir fanden heraus, dass Prdm2 KD in den dmPFC-BLA-Neuronen die Expression von Genen modulierte, die mit Angstkonditionierung, Angstzuständen, emotionalem Verhalten und Gedächtnis in Verbindung gebracht wurden (Ergänzungstabelle 2). Im Einklang mit der WCNA-Analyse umfasste das von IPA identifizierte wichtigste Gennetzwerk Veränderungen der Genexpression, die mit der Aktivierung der Synaptogenese verbunden sind (Abb. 4I). Dieses Netzwerk bestand aus Genen, die zu den Familien Ephrin, Neuroligin und Neurexin gehören, sowie aus SNARE-assoziierten Genen (z. B. Synaptotagmine, Abb. 4I, J). Es ist bekannt, dass diese Genfamilien zur Neurotransmission und Gedächtnisbildung beitragen [43,44,45].

Die durch unsere RNAseq-Analyse identifizierte translatorische Neuprogrammierung deutete auf die Möglichkeit hin, dass Prdm2 KD die Konsolidierung konditionierter Angst moduliert, indem es die synaptische Glutamatfreisetzung an dmPFC-BLA-Projektionszielen modifiziert. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, führten wir Scheibenelektrophysiologie-Experimente durch. Wir untersuchten zunächst die Auswirkungen von dmPFC Prdm2 KD auf die basalen synaptischen Eigenschaften von BLA, indem wir sEPSCs maßen, die von mutmaßlichen BLA-Hauptneuronen in durcheinandergemischten Kontrollen und Prdm2 KD-Ratten aufgezeichnet wurden (Abb. 5A). Prdm2 KD-Ratten zeigten eine erhöhte sEPSCs-Häufigkeit im Vergleich zu durcheinandergemischten Kontrollen (Abb. 5B, C; durcheinandergemischt: 3,74 ± 0,45 Hz, n = 14; Prmd2 KD: 5,63 ± 0,70 Hz, n = 15; t(27) = 2,24, p < 0,05, ungepaarter t-Test). Im Gegensatz dazu zeigten Prdm2-KD-Ratten keine signifikanten Unterschiede in der Amplitude (Abb. 5D; Durcheinander: 10,45 ± 0,41 pA, n = 14; Prmd2 KD: 10,71 ± 0,61 pA, n = 15; t(27) = 0,35, p = 0,73; ungepaarter t-Test) und Kinetik (Anstiegszeit: Verwürfelt: 2,16 ± 0,07 ms, n = 14; Prmd2 KD: 2,15 ± 0,06 ms, n = 15; t(27) = 0,08 p = 0,94, ungepaarter t-Test; Abklingzeit: Verwürfelt: 10,93 ± 0,51 ms, n = 14; Prmd2 KD: 10,43 ± 0,31 ms, n = 15; t(27)=0,85 p = 0,40, ungepaarter t-Test; Daten nicht gezeigt) von sEPSCs. Diese Daten legen nahe, dass Prdm2 KD im dmPFC die Glutamatfreisetzung auf BLA-Hauptneuronen erhöhte.

Ein repräsentatives Bild, das die virale Expression (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40) in dmPFC-Terminals zeigt, die auf die BLA abzielen. B Repräsentative sEPSCs-Spuren, aufgezeichnet von mutmaßlichen BLA-Hauptneuronen (PNs) in Scrambled- oder Prdm2-KD-Ratten. Maßstabsbalken: 50 pA × 500 ms. Kumulative Verteilungen und Balkendiagramme, die die Häufigkeit (C) und Amplitude (D) von sEPSCs zeigen, die aus mutmaßlichen BLA-PNs bei Ratten vom Typ „Scrambled“ oder „Prdm2 KD“ aufgezeichnet wurden. E Schematische Darstellung der Aufnahme- und Stimulationselektrodenstandorte für evozierte (e)EPSCs-Aufzeichnungen. F Repräsentative eEPSCs-Spuren, die durch gepaarte elektrische Stimulationen hervorgerufen wurden, die von mutmaßlichen BLA-PNs bei Scrambled- oder Prdm2-KD-Ratten aufgezeichnet wurden. Maßstabsbalken: 50 pA × 25 ms. G Balkendiagramme, die die mittleren PPR-Werte zeigen, die von mutmaßlichen BLA-PNs bei Ratten vom Typ „Scrambled“ oder „Prdm2 KD“ aufgezeichnet wurden. Balkendiagramme, die die Mittelwerte von 1/CV2 (H) und VMR (I) von eEPSCs zeigen, die von Scrambled- oder Prdm2-KD-Ratten (N = 5–6/Gruppe) aufgezeichnet wurden. *p < 0,05. J Schematische Darstellung des Faserphotometrie-Ansatzes (oben) und ein repräsentatives Bild (unten), das die implantierte optische Faser zeigt, die auf die BLA abzielt, und die Expression von zwei Viren, AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40, in dmPFC-Terminals, die darauf abzielen die BLA sowie AAV9.CaMKII.GCaMP6s.WPRE.SV40 in glutamatergen BLA-Neuronen. K-Spuren, die ein normalisiertes kalziumabhängiges GCaMP-Fluoreszenzsignal (Mittelwert ± SEM) in BLA-Neuronen von Scrambled- oder Prdm2-KD-Ratten zeigen, gemittelt über die ersten beiden Töne des Angstausdruckstests. Die Dauer des Tons wird durch das schattierte graue Kästchen angezeigt. Balkendiagramme, die einen größeren Spitzenwert des normalisierten GCaMP-Signals als Reaktion auf den Beginn des Tons (L) und eine vergrößerte Fläche unter der Kurve (AUC) des normalisierten GCaMP-Signals während der 5 Sekunden vor dem Ton und den ersten 5 Sekunden der Tonpräsentation (M) zeigen Prdm2-KD-Ratten im Vergleich zu Scrambled-Kontrollratten. BLA basolaterale Amygdala, CeA zentrale Amygdala, dmPFC dorsomedialer präfrontaler Kortex, LA laterale Amygdala, VMR-Varianz-zu-Mittelwert-Verhältnis, sEPSCs spontane erregende postsynaptische Ströme.

Um zu untersuchen, ob Prdm2 KD die Freisetzungswahrscheinlichkeit beeinflusst, verglichen wir das Paired-Pulse-Verhältnis (PPR) von elektrischen eEPSCs, die von mutmaßlichen BLA-Hauptneuronen von durcheinandergemischten Kontrollen und Prdm2 KD-Ratten aufgezeichnet wurden (Abb. 5E, F). In Übereinstimmung mit einer erhöhten Freisetzungswahrscheinlichkeit der glutamatergen BLA-Einträge beobachteten wir bei Prdm2-KD-Ratten im Vergleich zu Rührei-Kontrollen einen niedrigeren PPR (Abb. 5G; Rührei: 1,39 ± 0,13, n = 19; Prdm2 KD: 1,02 ± 0,07, n = 16). ; p < 0,05, Mann-Whitney-Test). Um ein unabhängiges Maß für Änderungen der Freisetzungswahrscheinlichkeit bereitzustellen, haben wir außerdem die durch Prdm2 KD hervorgerufenen Änderungen am umgekehrten Quadrat des Variationskoeffizienten (1/CV2) und des VMR von eEPSCs analysiert (46). Wir fanden heraus, dass Prdm2-KD-Ratten einen signifikant höheren Wert von 1/CV2 aufweisen (Abb. 5H; Rührei: 18,14 ± 4,62, n = 19; Prmd2 KD: 36,46 ± 8,08, n = 16; p < 0,05, Mann-Whitney-Test). und ein nahezu signifikant niedrigerer VMR-Wert (Abb. 5I; verschlüsselt: 17,04 ± 3,90, n = 19; Prmd2 KD: 7,91 ± 1,69, n = 16; p = 0,08, Mann-Whitney-Test). Obwohl gleichzeitige Änderungen in der Anzahl der Freisetzungsstellen funktioneller Vesikel nicht ausgeschlossen werden können, scheinen diese Daten mit den PPR-Ergebnissen übereinzustimmen, was weiter auf eine erhöhte Freisetzungswahrscheinlichkeit der glutamatergen Eingaben in die BLA nach dmPFC Prdm2 KD hindeutet. Zuletzt haben wir das AMPA/NMDA-Verhältnis gemessen, um festzustellen, ob Prdm2 KD auch die relative funktionelle Expression der glutamatergen BLA-AMPA- und NMDA-Rezeptoren verändern könnte. Prdm2 KD konnte das AMPA/NMDA-Verhältnis nicht verändern (Ergänzende Abbildung 5; Durcheinander: 2,97 ± 0,60, n = 12; Prmd2 KD: 2,76 ± 0,33, n = 12; p = 0,86, Mann Whitney-Test), was auf das Fehlen von hinweist postsynaptischer Umbau in den glutamatergen Synapsen, die als Reaktion auf Prdm2 KD zur BLA konvergieren.

Unsere Verhaltens- und Elektrophysiologiedaten deuten darauf hin, dass Prdm2 KD möglicherweise den Ausdruck von bedingter Angst verstärkt, indem es die Reaktivität von BLA-Pyramidenneuronen auf angstassoziierte Signale erhöht. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir Faserphotometrie, um die neuronale BLA-Aktivität während der Expression des Angstgedächtnisses zu messen (verschlüsselt: n = 9 und Prdm2 KD n = 13). Ein AAV-Vektor, der den fluoreszierenden Kalziumsensor GCaMP6s unter der Kontrolle des CaMKII-Promotors kodiert, wurde einseitig in die BLA von Prdm2-KD-Ratten und durcheinandergemischten Kontrollen injiziert, gefolgt von der Implantation einer optischen Faser (Abb. 5J). Die Ratten durchliefen eine Angstkonditionierungssitzung und wurden 24 Stunden später wie zuvor auf den durch Reize ausgelösten Ausdruck konditionierter Angst getestet. Während der Testsitzung wurde die Kalziumaktivität in der BLA gemessen. Zur Bestätigung unserer Hypothese wurden bei den ersten beiden Präsentationen des angstassoziierten Tonus bei Prdm2-KD-Ratten im Vergleich zu durcheinandergemischten Kontrollen größere Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz beobachtet (Abb. 5K). Dieser Effekt wurde sowohl bei der Messung des normalisierten GCaMP-Spitzensignals als Reaktion auf den Tonbeginn (Abb. 5L; t(20) = 2,37, p = 0,03) als auch bei der Berechnung der Fläche unter der Kurve (AUC) des normalisierten GCaMP-Signals beobachtet während der 5 s vor dem Ton und den ersten 5 s der Tonpräsentation (Abb. 5M; Behandlungseffekt: F(1,20) = 5,28; p = 0,03).

Wir berichten über eine mechanistische Rolle des epigenetischen Enzyms PRDM2 bei der Modulation der Angstgedächtniskonsolidierung durch die Regulierung des dmPFC-BLA-Neuronenwegs. Wir zeigen, dass eine verstärkte Angstexpression nach Prdm2 KD aus einer erhöhten Expression von Genen resultieren kann, die an der Freisetzung von Neurotransmittern beteiligt sind, was zu einer erhöhten Aktivität der glutamatergen dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen während des Angstgedächtnisabrufs führt. Zusammengenommen liefern unsere Ergebnisse einen neuartigen molekularen Mechanismus, durch den die dmPFC-BLA-Projektion eine übermäßige und anhaltende Angstreaktion fördern kann.

Umfangreiche Belege belegen die Rolle präfrontaler Cortex-Amygdala-Schaltkreise bei der Regulierung von Angst und Unruhe [12,13,14]. Funktionelle Bildgebungsstudien am Menschen zeigen eine erhöhte funktionelle Konnektivität zwischen dem dmPFC/anterioren cingulären Kortex (ACC) und der Amygdala während der Bedrohungsverarbeitung bei gesunden Personen [47]. Bei Personen mit generalisierten oder sozialen Angststörungen weisen Patienten mit den schwersten Symptomen auch die höchste dmPFC/ACC-Amygdala-Konnektivität auf, was darauf hindeutet, dass dieser Schaltkreis nicht nur an adaptiven, sondern auch an maladaptiven Reaktionen auf Stress beteiligt ist [48]. In Übereinstimmung mit der Rolle des dmPFC/ACC-Amygdala-Signalwegs bei adaptiven Stressreaktionen zeigen Tierversuche, dass der Ausdruck von Angst entscheidend von der Aktivierung des dmPFC-BLA-Signalwegs abhängt [11]. Ausgelöste konditionierte Angst stärkt die erregenden dmPFC-Synapsen in der BLA [12], und die optogenetische Stummschaltung der dmPFC-Terminals in der BLA verringert sowohl den Angstausdruck als auch die aktive Vermeidung [13, 49].

Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen Beobachtungen überein und liefern einen möglichen molekularen Mechanismus dafür, wie maladaptive Angstreaktionen entstehen können. Wir zeigen, dass Prdm2 KD im dmPFC-BLA-Weg ausreicht, um den Ausdruck konditionierter Angst zu verstärken. Wir fanden auch heraus, dass Prdm2 KD tiefgreifende Veränderungen im Translationsprofil von dmPFC-BLA-Neuronen induziert und eine erhöhte glutamaterge Neurotransmission in der BLA fördert. Insbesondere veränderte Prdm2 KD das Translationsprofil von 100 Genen, die an der Synaptogenese beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass PRDM2 eine wichtige Rolle bei der Regulierung synaptischer Funktionen spielt. Prdm2 KD erhöhte die Expression von Genen, die für den SNARE-Komplex (Synaptotagmine und Syntaxine) und N-Typ-Kalziumkanäle kodieren. Darüber hinaus erhöhte Prdm2 KD die Expression von Genen, die zu Zelladhäsionsproteinfamilien gehören (z. B. Neurexine, Neuroligine, Ephrine), von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei der synaptischen Übertragung und synaptischen Plastizität spielen (44, 45, 50). Es ist wichtig zu beachten, dass beim vTRAP-Ansatz nur mRNAs sequenziert werden, die mit Ribosomen assoziiert sind (dh die gerade translatiert werden). Translatierende mRNAs korrelieren daher enger mit den Proteinspiegeln, was dazu führt, dass Änderungen in der translatierenden mRNA nach Prdm2-KD mit größerer Wahrscheinlichkeit funktionelle Auswirkungen auf die neuronale Aktivität haben und folglich Gedächtnisprozesse befürchten. Unsere translatomischen Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Prdm2 KD die Freisetzung von Neurotransmittern erleichtert, indem es die Expression von Genen erhöht, die die synaptische Vesikelfusion steuern. Diese Hypothese wird durch unsere Patch-Clamp-Aufzeichnungen gestützt, die auf eine erhöhte Neurotransmitter-Freisetzungswahrscheinlichkeit bei glutamatergen Eingaben in die BLA bei Prdm2-KD-Ratten im Vergleich zu durcheinandergemischten Kontrollen hinweisen. Darüber hinaus zeigten Prdm2-KD-Ratten eine erhöhte neuronale Aktivität in der BLA während des Angstausdrucks, was darauf hindeutet, dass Prdm2-KD den Angstausdruck durch eine erhöhte synaptische Wirksamkeit der dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen verstärken könnte.

Unsere Daten deuten auch darauf hin, dass Prdm2 KD den Angstausdruck verstärkt, indem es die Konsolidierung des Angstgedächtnisses erhöht, einen Prozess, durch den neu erworbene Erinnerungen stabilisiert werden, um ein Langzeitgedächtnis zu bilden [51]. Die Stärke einer Gedächtniskonsolidierung kann die individuelle Variation der Angstreaktionen beeinflussen. Beispielsweise kann eine „übermäßige Konsolidierung“ einer mit einem Trauma verbundenen Erinnerung eine stärkere Reaktion hervorrufen und eine Person anfälliger für die Entwicklung einer traumabedingten pathologischen Angst machen [52, 53]. Im Einklang mit der Rolle von Prdm2 bei der Konsolidierung des Angstgedächtnisses wurde festgestellt, dass mehrere Gene, die durch Prdm2 KD moduliert werden, einschließlich des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors und des Gens Cyclic AMP-Responsive Element-Binding Protein 1, mit der Konsolidierung des Angstgedächtnisses assoziiert sind [54]. ,55,56,57]. Darüber hinaus zeigt eine aktuelle Studie von Chen et al. [58] zeigten, dass die Konsolidierung des Angstgedächtnisses mit einer erhöhten Expression von Genen verbunden ist, die für Proteine ​​des SNARE-Komplexes sowie für mehrere Neuroligine und Neurexine kodieren. In einer Art Priming-Mechanismus könnte die erhöhte Expression dieser Gene vor der Angstexposition zu einer anschließenden übermäßigen Konsolidierung von Angsterinnerungen führen. Da eine längere Exposition des Gehirns gegenüber Alkohol die Prdm2-Expression im dmPFC herunterreguliert [23], liefern unsere Ergebnisse auch einen möglichen Mechanismus für eine erhöhte Anfälligkeit für eine pathologische Überkonsolidierung von Angsterinnerungen bei Menschen mit Alkoholkonsumstörungen, was mit der hohen CO-Konzentration übereinstimmt -Morbidität von übermäßigem Alkoholkonsum und PTBS [59].

Zusammenfassend schlagen wir einen neuartigen Mechanismus für eine erhöhte Konsolidierung des Angstgedächtnisses vor, bei dem eine verringerte Prdm2-Expression in den dmPFC-BLA-projizierenden Neuronen zu translatomischen Veränderungen führt, die eine erhöhte synaptische Wirksamkeit im BLA und erhöhte neuronale dmPFC-BLA-Reaktionen auf stressassoziierte Hinweise fördern. Diese Studie liefert auch den ersten Beweis für eine Rolle von PRDM2 bei stressbedingten Störungen. Angesichts unserer früheren Erkenntnisse, dass Alkoholabhängigkeit die dmPFC-PRDM2-Expression herunterreguliert [23], liefern wir schließlich einen möglichen Mechanismus für die umfassende Komorbidität von Alkoholkonsum und Angststörungen.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01827-w

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. K. Meletis für seine Unterstützung beim vTRAP-Experiment. Wir danken Dr. V. Loitto und der Core Facility – Microscopy Unit der Medizinischen Fakultät der Universität Linköping für technische Unterstützung. Wir danken der Kerneinrichtung NGI Stockholm – SciLifeLab für die Durchführung der Bibliotheksvorbereitung und RNA-Sequenzierung. Diese Arbeit wurde vom Schwedischen Forschungsrat (Stipendium Nr. 2013–07434), der Region Östergotland, Stiftelsen Psykiatriska Forskningsfonden, der Wallenberg Foundation und dem Knut och Alice Wallenberg Stiftelse Grant finanziert. CC ist ein Wallenberg Molecular Medicine Fellow und erhält großzügige finanzielle Unterstützung von der Knut and Alice Wallenberg Foundation. Die Autoren berichten über keine biomedizinischen finanziellen Interessen oder potenziellen Interessenkonflikte.

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Linköping.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee.

Zentrum für soziale und affektive Neurowissenschaften, Abteilung für Biomedizinische und Klinische Wissenschaften, Universität Linköping, S-581 85, Linköping, Schweden

Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke, Ilona Szczot, Eric Augier, Markus Heilig und Estelle Barbier

Abteilung für Physiologie, Medizinische Fakultät Siriraj-Krankenhaus, Mahidol-Universität, Bangkok, Thailand

Kanat Chanthongdee

Wallenberg-Zentrum für Molekulare Medizin, Universität Linköping, Linköping, Schweden

Simon Söderholm & Claudio Cantù

Abteilung für Biomedizinische und Klinische Wissenschaften, Abteilung für Molekulare Medizin und Virologie; Fakultät für Medizin und Gesundheitswissenschaften, Universität Linköping, Linköping, Schweden

Simon Söderholm & Claudio Cantù

Abteilung für Suchtbiologie, Abteilung für Psychiatrie und Neurochemie, Institut für Neurowissenschaften und Physiologie, Sahlgrenska-Akademie, Universität Göteborg, Göteborg, Schweden

Ana Domi & Louise Adermark

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EB und MH konzipierten und gestalteten die Studien. EB entwarf und überwachte Experimente, analysierte und interpretierte die Ergebnisse. RB, KC, EB, EA und GA führten die Verhaltensexperimente durch. RB, KC, CA und EB führten die molekulare Analyse durch. EB, ED, RB, LX und MP führten Operationen durch. MP, AD, LA führten elektrophysiologische Aufzeichnungen und Analysen durch. SS und CC führten die bioinformatische Analyse der RNA-Sequenzierungsdaten durch. JW und IS analysierten die Faserphotometriedaten. EB, RB und MH haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Estelle Barbier.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Die ursprüngliche Online-Version dieses Artikels wurde überarbeitet: In der Originalversion dieses Artikels sind die Vor- und Nachnamen von Riccardo Barchiesi, Kanat Chanthongdee, Michele Petrella, Li Xu, Simon Söderholm, Esi Domi, Gaelle Augier, Andrea Coppola, Joost Wiskerke aufgeführt , Ilona Szczot, Ana Domi, Louise Adermark, Eric Augier, Claudio Cantù, Markus Heilig, Estelle Barbier waren falsch strukturiert. Die Namen wurden zum Zeitpunkt der Veröffentlichung in allen Versionen korrekt angezeigt. Der Originalartikel wurde korrigiert.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Barchiesi, R., Chanthongdee, K., Petrella, M. et al. Ein epigenetischer Mechanismus zur übermäßigen Konsolidierung von Angsterinnerungen. Mol Psychiatry 27, 4893–4904 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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Eingegangen: 17. Dezember 2021

Überarbeitet: 09. August 2022

Angenommen: 18. August 2022

Veröffentlicht: 21. September 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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