Der cholinerge basale Vorderhirnkern von Meynert reguliert chronische Schmerzen

May 28, 2023

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5014 (2022) Diesen Artikel zitieren

3805 Zugriffe

10 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Der Basalkern von Meynert (NBM) erfüllt durch seine tiefgreifende Modulation der neokortikalen Aktivität entscheidend wichtige Funktionen in den Bereichen Aufmerksamkeit, Erregung und Kognition und entwickelt sich zu einem Schlüsselziel bei Alzheimer- und Parkinson-Demenzerkrankungen. Trotz der entscheidenden Rolle neokortikaler Domänen bei der Schmerzwahrnehmung wurde die NBM jedoch nicht in Modellen chronischer Schmerzen untersucht. Hier berichten wir anhand von In-vivo-Tetrodenaufzeichnungen bei sich verhaltenden Mäusen, dass Beta- und Gamma-Oszillationsaktivität im NBM durch schädliche Reize hervorgerufen wird und bei entzündlichem, schmerzähnlichem Verhalten am Höhepunkt erleichtert wird. Optogenetische und chemogenetische zellspezifische, reversible Manipulationen von cholinergen-GABAergen NBM-Neuronen zeigen ihre Rolle bei der endogenen Kontrolle der nozizeptiven Überempfindlichkeit, die sich über Projektionen auf den prälimbischen Kortex manifestiert und zu einer durch Schicht 5 vermittelten Antinozizeption führt. Unsere Daten enthüllen die Bedeutung des NBM für die Top-Down-Kontrolle der neokortikalen Verarbeitung schmerzähnlichen Verhaltens.

Ein großes Hindernis für eine adäquate Therapie chronischer Schmerzstörungen ist das unvollständige Wissen über die Schaltkreise im Gehirn, die der Schmerzwahrnehmung zugrunde liegen, und deren Modulation beim Übergang vom akuten zum chronischen Schmerz. Ihre Aufklärung ist daher wichtig für die Gewinnung mechanistischer Erkenntnisse sowie für den therapeutischen Fortschritt. Jüngste Studien zur funktionellen Untersuchung von Gehirnschaltkreisen haben zu Durchbrüchen bei den Struktur-Funktions-Eigenschaften einiger Gehirnnetzwerke geführt, die an Schmerzen beteiligt sind, und haben insbesondere Schlüsselrollen für neokortikale Domänen aufgedeckt1. Die Schmerzwahrnehmung unterliegt einer tiefgreifenden Modulation durch kontextuelle, umweltbedingte und psychosoziale Faktoren. Als beitragende neuronale Mechanismen zeichnen sich nun Erkenntnisse über die Modulation der neokortikalen Verarbeitung durch afferente Eingaben von GABAergen, dopaminergen und serotonergen Signalwegen ab2.

Im Vergleich dazu ist sehr wenig über den Umfang und die Funktionen cholinerger Signalwege im Gehirn bei der Modulation der Schmerzwahrnehmung bekannt. Dies steht im Gegensatz zu umfangreichen pharmakologischen Studien aus den letzten zwei Jahrzehnten, die über Auswirkungen der cholinergen Signalübertragung sowohl über ionotrope Nikotinrezeptoren als auch über metabotrope Muskarinrezeptoren auf Schmerzen und Analgesie berichten3. Die systemische, periphere und spinale Verabreichung cholinerger Liganden moduliert die Nozizeption, und Studien mit zentraler Verabreichung haben cholinerge Signale mit der opioidergen Analgesie und absteigenden Modulationssystemen in Verbindung gebracht. Bei der Nutzung der cholinergen Modulation zur Schmerzlinderung wurden jedoch nur sehr geringe Fortschritte erzielt, was in erster Linie auf große Lücken im Verständnis der zugrunde liegenden Schaltkreise zurückzuführen ist, insbesondere im Hinblick auf die Abgrenzung des Ursprungs cholinerger Eingaben. Dies ist besonders wichtig, da sowohl erleichternde als auch hemmende Wirkungen mit der pharmakologischen Modulation cholinerger Rezeptoren verbunden sind, was nicht nur auf die Vielfalt der rezeptorvermittelten Signalübertragung, sondern auch auf den Ort der cholinergen Modulation im Nervensystem zurückzuführen ist.

Im Gehirn sind cholinerge Neuronen reichlich vorhanden, entweder in Form von lokalen Interneuronen in bestimmten Bereichen, wie dem caudatus putamen, oder sie sind in den cholinergen Kernen Ch1–Ch6 des basalen Vorderhirns und des Hirnstamms organisiert, um als Projektionsneuronen mit entfernten Zielen zu fungieren4. Unter diesen umfasst das basale Vorderhirnsystem diskrete Gruppen cholinerger Zellen (Ch1–Ch4), wobei Neuronen im medialen Septum (MS) und im vertikalen Schenkel des diagonalen Broca-Bandes (vDB) hauptsächlich auf den Hippocampus abzielen, während die Neuronen in Ch4 ist größtenteils für den cholinergen Input in den neokortikalen Mantel verantwortlich und projiziert auch in die Amygdala4. Im Gehirn von Nagetieren ist die Struktur, die dem Ch4 am ähnlichsten ist, durch den Nucleus basalis magnozelluläris (NBM; Basalkern von Meynert) gegeben, der sich auch in ein Band ventral der vorderen Kommissur erstreckt, das als Substantia innominata bezeichnet wird und zusammenfassend als bezeichnet wird Begriff NBM in dieser Studie, im Einklang mit mehreren anderen veröffentlichten Studien (z. B. Lit. 5; schematische Ansicht in Abb. 1a). Dieser Sektor enthält den größten Anteil kortikopetaler Projektionen aus dem basalen Vorderhirn und ist überwiegend cholinerger Natur. Dem NBM wird eine modulierende Rolle bei bestimmten Schlüsselfunktionen wie Erregung, Aufmerksamkeit, Angst und sozialen Interaktionen, einschließlich des Gedächtnisses für soziale Anerkennung, zugeschrieben5. Darüber hinaus ist das NBM daran beteiligt, die Schärfe der sensorischen Verarbeitung zu schärfen, indem es das „Signal-Rausch“-Verhältnis in kortikalen Schaltkreisen über nikotinische und muskarinische Mechanismen verbessert, an denen sowohl Pyramidenneuronen als auch GABAerge Interneurone beteiligt sind6,7. Diese Eigenschaften versetzen das NBM angesichts der Bedeutung der neokortikalen Verarbeitung bei Schmerzen möglicherweise in eine entscheidende Position, um die Schmerzwahrnehmung und ihre Plastizität zu modulieren1. Überraschenderweise wurde die NBM jedoch kaum im Zusammenhang mit Schmerzen untersucht, abgesehen von einigen Studien mit exzitotoxischen Läsionen und einer breiten Toxin-vermittelten Ablation cholinerger Gruppen. Wichtig ist, dass es keine Studien gibt, die die zugrunde liegende native Schaltung funktionell beschreiben. Darüber hinaus bleibt unklar, ob und wie sich Aktivitätsmuster im NBM im Zusammenhang mit Schmerzen ändern und das NBM beim Übergang zu chronischen Schmerzen in vivo eine Plastizität erfährt.

a Schematische Darstellung der wichtigsten cholinergen Kerne im Gehirn von Mäusen (b, c) Typische Beispiele (a) und Quantifizierung (b) des Capsaicin-induzierten Anstiegs der Fos-Immunhistochemie in cholinergen NBM-Neuronen (ChAT + ve; Pfeile: co-markierte Zellen). n = 3 Mäuse/Gruppe; P < 0,05 (*0,0103, #0,0263), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. d Schematische Darstellung (aus Lit. 31) von In-vivo-Tetrodenaufzeichnungen im NBM (weißer Pfeil: Elektrodenspitzenläsion im Schnitt) als Reaktion auf die mechanische Stimulation der Hinterpfote durch von Frey. e Mittlere Zeit-Frequenz-Darstellung der spektralen Modulation im NBM für alle Versuche mit Pfotenrückzugsreaktion entweder auf schwache Filamente (0,07 g und 0,16 g) oder starke Filamente (0,6 g und 1 g). f, g Entsprechende Quantifizierung der Leistung (f) der Oszillationsaktivität in den Frequenzbereichen Theta (4–8 Hz), Alpha (8–14 Hz), Beta (14–30 Hz) und Gamma (30–100 Hz), dargestellt als %-Änderung im Zeitraum von 2 s nach der Anwendung gegenüber der Basisaktivität von 1 s vor der Stimulusanwendung und entsprechender Zeitverlauf (g); vertikale blaue Linie: Zeitpunkt des Pfotenrückzugs. In e, g, n = 5 Mäuse; *P < 0,05; In f wurde ein t-Test mit einer Stichprobe (zweiseitig) eingesetzt; Die t- und P-Werte für die verschiedenen Gruppen sind wie folgt: Schwache Filamente: t = 2,06, 1,89, 3,10, 2,60; P = 0,108, 0,132, 0,036, 0,060; Starke Filamente: t = 2,50, 2,57, 3,07, 3,81; P = 0,067, 0,062, 0,037, 0,019; für Theta, Alpha, Beta bzw. Gamma. Eine Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Dunnets Mehrfachvergleich gegenüber der Basislinie vor der Stimulation wurde in g eingesetzt (*P = 0,0058, 0,0007, 0,0143, 0,0048, 0,0021, 0,0019, 0,0106, 0,0013, 0,0005, 0,0007, 0,0001, 0,0). 028, 0,0013, 0,0006, 0,0011, 0,0148 für Beta und 0,0091, 0,0002, 0,0045, 0,0012, 0,0001, 0,0022, 0,0036, 0,0016, 0,0005, 0,0012, 0,0451, 0,001 5, 0,0124, 0,0197 für Gamma-Leistungszeitintervalle, jeweils von links nach rechts). Maßstabsbalken repräsentieren 0,5 mm und 50 µm (rechts) in b und 250 µm in d. MS medialer Septumkern, vDB-Diagonalband von Broca, LDT laterodorsaler Tegmentkern, PPT pedunculopontiner Tegmentkern, mPFC medialer präfrontaler Kortex, ac anteriore Kommissur, CPu caudate putamen, GP Glopus pallidus, LOT-Kern des lateralen Riechtrakts, mfb mediales Vorderhirnbündel , IC-interne Kapsel, ERP-ereignisbezogenes Potenzial oder Störung. Die Daten werden als Mittelwert +/– Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt.

Hier führten wir In-vivo-Aufzeichnungen mit Tetroden durch, um Veränderungen in der Aktivität einzelner Neuronen sowie oszillierende Feldrhythmen im NBM in sich frei bewegenden, sich verhaltenden Mäusen während der Nozizeption und dem Übergang zur entzündlichen Überempfindlichkeit dynamisch zu erfassen. Wir berichten über spezifische Reaktionen des NBM auf schmerzauslösende (schädliche) Reize, die einen Wechsel der Reaktion auf Reize geringer Intensität in einem entzündlichen Schmerzmodell zeigen und somit eine Verhaltensüberempfindlichkeit widerspiegeln. Gleichzeitig erfahren Gamma- und Beta-Oszillationsrhythmen eine Potenzierung der spektralen Leistung. Mithilfe reversibler, zelltypspezifischer chemogenetischer und optogenetischer Manipulationen in Verbindung mit Verhalten zeigen wir, dass diese Potenzierung der cholinergen Aktivität im NBM und ihrer Projektionen auf den präfrontalen Kortex die nozizeptive Überempfindlichkeit sowohl bei entzündlichen als auch bei neuropathischen Schmerzzuständen unterdrückt und so den Weg ebnet therapeutische Strategien, die speziell auf diese cholinergen Zellgruppen abzielen.

Die intraplantare Injektion von Capsaicin in die Hinterbeine bei Wildtyp-Mäusen, die akut starke, tonische Schmerzen hervorruft, führte zu einem signifikanten Anstieg der Expression des aktivitätsabhängigen unmittelbar frühen Genprodukts Fos im NBM (schematisch dargestellt in Abb. 1a). einschließlich cholinerger Neuronen, wie durch Co-Markierung für den Marker Cholinacetyltransferase (ChAT; Abb. 1b) zu sehen ist. Als nächstes konzentrierten wir uns auf diesen Bereich in elektrophysiologischen Experimenten an wachen, sich verhaltenden Mäusen, um Veränderungen in der NBM-Aktivität direkt zu untersuchen, sowohl auf der Ebene der Feldpotentiale als auch auf der Ebene einzelner Zellen mithilfe von Tetroden. Die Anwendung mechanischer Kraft über Von-Frey-Filamente war mit einem Anstieg der Aktivität in allen Frequenzbändern gegenüber dem Basisaktivitätsniveau (vor dem Stimulus) verbunden (Abb. 1d, e; siehe auch ergänzende Abb. 1a). Über mehrere Versuche und Tiere hinweg war der Anstieg der Stärke der Beta-Oszillationen (14–30 Hz) statistisch signifikant, wenn Reize an und über den nozizeptiven Schwellenwerten angewendet wurden (von-Frey-Kraft von 0,6–1,0 g) sowie bei geringer Intensität , nicht schädliche taktile Reize (0, 07–0, 16 g), wohingegen die Leistung der Gammaschwingungen (30–100 Hz) mit der nozizeptiven Kraftstimulation selektiv zunahm (Abb. 1f). Dieser Befund ist besonders interessant, da Gamma-Oszillationen in kortikalen Bereichen sowohl in Studien an Menschen als auch an Nagetieren funktionell mit der Nozizeption in Verbindung gebracht wurden8,9,10 und bekanntermaßen mit der Synchronisierung der Aktivität über GABAerge Interneurone verbunden sind11. Der durch schädliche mechanische Stimulation induzierte Anstieg der Beta- und Gammaaktivität erreichte vor der nozifensiven Verhaltensreaktion statistisch signifikante Werte und blieb nach Anwendung des Reizes 2 Sekunden lang bestehen (Abb. 1g, zum Vergleich: Daten zur nicht schädlichen Stimulation). dargestellt in der ergänzenden Abbildung 2b).

Als nächstes versuchten wir, die potenzielle Bedeutung des NBM für das Fortschreiten der Nozizeption zur Überempfindlichkeit zu testen, die für anhaltende entzündliche Schmerzen charakteristisch ist. Tatsächlich zeigten Mäuse mit einseitiger Hinterpfotenentzündung, die durch Injektion von komplettem Freund-Adjuvans (CFA) induziert wurde und eine nozizeptive Überempfindlichkeit zeigt (ergänzende Abbildung 1c), eine erhöhte Fos-Expression in cholinergen Neuronen im NBM (Abb. 2a, b). Anschließend verglichen wir die Oszillationsaktivität zwischen naiven Bedingungen und nach Feststellung einer CFA-induzierten Überempfindlichkeit. 24 Stunden nach der CFA-Injektion in die Hinterpfote, was dem Zeitpunkt entspricht, zu dem die Verhaltensüberempfindlichkeit gegenüber mechanischer Stimulation in unseren Händen ihren Höhepunkt erreicht, löste die Pfotenstimulation einen deutlich stärkeren Anstieg der Leistung von Beta- und Gamma-Rhythmen aus (Abb. 2c, d ), jedoch nicht der Alpha- und Theta-Aktivität (Ergänzende Abbildung 1d) im NBM. Ein interessanter Befund war, dass der mit Entzündungsschmerzen verbundene Anstieg der Gamma- und Betakraft bei geringen Intensitäten mechanischer Stimulation beobachtet wurde, die unter physiologischen Bedingungen typischerweise nicht schädlich sind, im entzündeten Zustand jedoch als schädlich empfunden werden (Abb. 2e). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das NBM während der Nozizeption rekrutiert wird und seine Reaktionsfähigkeit beim Übergang zur Überempfindlichkeit bei entzündlichem, schmerzähnlichem Verhalten erleichtert.

a, b Vergleich der Aktivität cholinerger Neuronen des NBM in Gegenwart oder Abwesenheit einer mechanischen Stimulation mit einer Kraft von 0,16 g auf die kontralaterale plantare Hinterpfote unter Ausgangsbedingungen oder 1 Tag nach der CFA-Injektion. Dargestellt sind typische Beispiele (a) und Quantifizierung (b); n = 4 Mäuse/Gruppe; P < 0,05 (*0,0005, #0,0134), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. c Zeit-Frequenz-Darstellung der spektralen Leistung im NBM bei Mäusen am Tag 1 nach der CFA-Injektion (n = 5 Mäuse/Behandlung). d, e Vergleich der Stärke der Oszillationsaktivität in Beta- und Gamma-Frequenzbereichen zwischen naiven (Schein-)Bedingungen und CFA-Tag 1, berechnet als prozentualer Anstieg im Zeitraum von 2 s nach der Anwendung gegenüber der Basisaktivität von 1 s vor der Stimulusanwendung. Dargestellt sind Reiz-Reaktions-Kurven (d) oder eine Analyse der prozentualen Änderung der spektralen Leistung (e) als Reaktion auf harmlose Filamente (0,07 und 0,16 g) und schädlichen mechanischen Druck (0,6–1,0 g); n = 5 Mäuse/Gruppe; *P < 0,05 (0,0417 für 0,07 g, 0,0244 für 0,16 g in d; 0,0425 für Beta-schwach und 0,0095 für gamma-schwach in e), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Die Analyse der Aktivität auf Einzelzellebene mittels Spike-Sortierung führte zu interessanten Erkenntnissen über die zelluläre Natur der NBM-Reaktionsfähigkeit und -Plastizität bei Schmerzen. Von den 221 Einheiten, die unter naiven Bedingungen aufgezeichnet wurden, zeigten weniger als 10 % einen konsistenten Anstieg oder Rückgang der Feuerrate in Entzugsversuchen nach Anwendung von 20 mechanischen Pfotenstimulationen mit dem schwachen oder starken Filament (Abb. 3a, b); Beispielspuren und durchschnittliche Z-Scores (die die Anzahl der Standardabweichungen für Datenpunkte über oder unter dem Mittelwert angeben) sind in Abb. 3a und die Einheitenproportionen in Abb. 3b dargestellt. Bei Mäusen mit entzündlich-schmerzähnlichem Verhalten änderte sich der Anteil der Einheiten, die auf mechanische Stimulation reagierten, bei starker Überempfindlichkeit in den ersten 4 Tagen nach der CFA-Injektion nicht signifikant (Abb. 3b und ergänzende Abb. 2a). In diesem Zeitraum stiegen die maximalen Z-Score-Werte jedoch in Neuronen, die durch schädliche Intensitäten mechanischer Stimulation erregt wurden, signifikant an (Abb. 3c), nicht jedoch in Neuronen, die durch mechanische Stimulation gehemmt wurden (ergänzende Abb. 2b), was dem Gesamtanstieg der entspricht Kraft der Oszillationsaktivität, die wir auf der LFP-Ebene beobachtet haben. Darüber hinaus haben wir durch Analyse der Form der Spitzenwellenform die Einheiten in Klasse 1 (Abb. 3d) und Klasse 2 (Abb. 3e) mit breiten bzw. schmalen Spitzenwellenformen klassifiziert12; Schnellspitzenklassen von GABAergen Projektionsneuronen und Interneuronen sind in Einheiten der Klasse 2 vertreten13. Interessanterweise zeigten nur Neuronen der Klasse 2 einen statistisch signifikanten Anstieg der Aktivität als Reaktion auf sensorische Stimulation bei Mäusen mit Pfotenentzündung im Vergleich zu Kontrollmäusen (Abb. 3d, e). Diese Daten deuten darauf hin, dass NBM-Neuronen, die durch mechanische Reize erregt werden, die Manifestation einer entzündlichen nozizeptiven Überempfindlichkeit begünstigen und dass außerdem schnell ansteigende, GABAerge Klasse-2-Neuronen im NBM besonders zu diesen Veränderungen beitragen. Dieser Befund ist bemerkenswert, da im Maus-NBM bekannt ist, dass 92 % der ChAT-exprimierenden cholinergen Neuronen GABAerge sind14. Zu späten Zeitpunkten nach der CFA-Injektion (7–14 Tage), nachdem die normale nozizeptive Empfindlichkeit wiederhergestellt war, beobachteten wir, dass sich die Muster der Oszillations- und Einzelzellaktivität im NBM nicht nur normalisierten, sondern teilweise sogar unter die Ausgangswerte fielen (Ergänzende Abbildungen). 2b und 3a, b).

a Typische Beispiele (obere Felder) und durchschnittliche Z-Scores, die die Anzahl der Standardabweichungen für Datenpunkte über oder unter dem Mittelwert darstellen, zeigen NBM-Einheiten, die durch schädliche Stimulation der Pfote angeregt werden (Feld ganz links), Einheiten, die es sind durch Pfotenstimulation in ihrer Aktivität unterdrückt (mittleres Feld) und Einheiten, deren Aktivität nach Pfotenstimulation nicht wesentlich verändert wird. b Verteilung der NBM-Einheiten, die auf mechanische Stimulation unter naiven (Schein-)Bedingungen und während CFA-induziertem, entzündlichem, schmerzähnlichem Spitzenverhalten der Hinterpfoten reagieren (Tag 1–4). c–e Die maximale Steigerung der Aktivität gegenüber den durchschnittlichen Ausgangswerten für Einheiten, die durch mechanische Stimulation angeregt werden, wird bei naiven Mäusen und nach CFA gezeigt. In d, e werden die Einheiten basierend auf der Wellenform in Neuronentypen der Klassen 1 (d) und 2 (Fast Spiking; e) unterteilt. n = 5 Mäuse/Gruppe; *P < 0,05 (0,0412 in c; 0,0191 in e), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest (c) und ungepaarter zweiseitiger t-Test (d, e). Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Um die Bedeutung unserer Ergebnisse direkt aufzudecken, verwendeten wir einen zellspezifischen optogenetischen Ansatz, indem wir den durch blaues Licht gesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin gezielt auf ChAT-exprimierende Neuronen richteten. Rekombinante Adeno-assoziierte Virionen (AAV) wurden stereotaktisch injiziert, um gelb fluoreszierendes, mit Protein markiertes Channelrhodopsin in Cre-abhängiger Weise (rAAV-Dio-ChR2-YFP) einseitig im NBM von transgenen ChAT-Cre-Mäusen zu exprimieren (Abb. 4a, b). ). Als Kontrollen dienten Cre-negative Mäuse, die den gleichen Behandlungen unterzogen wurden. Die Zufuhr von blauem Licht zum NBM über chronisch implantierte optische Fasern erhöhte die Fos-Expression in cholinergen Neuronen signifikant und begründete damit die In-vivo-Validierung des Ansatzes (Abb. 4c, d). Bei der Stimulation mit blauem Licht blieb die Grundempfindlichkeit gegenüber mechanischen Reizen unverändert (Abb. 4e, Grundlinie); Allerdings war die Verschiebung der von Frey-Stimulus-Reaktionsfunktion nach links und oben, die die Manifestation einer entzündlichen Überempfindlichkeit darstellt, bei Cre+-Mäusen im Vergleich zu Cre--Kontrollen signifikant verringert, wenn sie am Tag 2 nach CFA bei maximaler Sensibilisierung getestet wurden (Abb. 4e, mittleres Feld). Ebenso war die mechanische Rückzugsschwelle bei Mäusen mit CFA nach Blaulichtstimulation in Cre+ signifikant erhöht, nicht jedoch bei Kontroll-Cre-Mäusen (Abb. 4f). Insgesamt war das Ausmaß der mechanischen Überempfindlichkeit gegenüber den Ausgangswerten verringert und die Rückkehr zur Ausgangsempfindlichkeit erfolgte schneller nach optogenetischer Stimulation von cholinergen NBM-Neuronen (Abb. 4f). Die CFA-induzierte Hitzehyperalgesie veränderte sich jedoch weder in ihrem Ausmaß noch in ihrer Dauer signifikant (Abb. 4g).

ein Schema zur optogenetischen Manipulation cholinerger NBM-Neuronen mit blauem Laserlicht. b–d Expression des exzitatorischen Opsins Channelrhodopsin-EYFP im NBM (b), typische Beispiele (c) und Quantifizierung (d) der verstärkten Fos-Expression in EYFP+- und ChAT+-Neuronen (Pfeile in c) mit blauem Licht, wodurch die validiert wird Wirksamkeit der optogenetischen Aktivierung in vivo. n = 3 Mäuse/Gruppe; *P < 0,05 (0,0234, oben; 0,0183, unten), ungepaarter zweiseitiger t-Test. Maßstabsbalken = 200 µm in b und 25 µm in c. e, f Signifikante Abschwächung der maximalen mechanischen Überempfindlichkeit (Tag 2), die durch die intraplantare CFA-Injektion induziert wurde, dargestellt als Reiz-Reaktions-Kurven (e) und Entzugsschwellen (f) als Reaktion auf die von-Frey-Stimulation; Die P-Werte im Einschub stellen einen ANOVA-basierten Vergleich der beiden gesamten Reiz-Reaktions-Kurven dar. g Fehlende Modulation der Überempfindlichkeit gegenüber einem Hitzeanstieg. e, fn = 7 ChAT-Cre- und 8 ChAT-Cre+ Mäuse; P < 0,05 (*0,0275, Mitte in e; *0,0139, #0,0231, Mitte in f), Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Da die NBM-Projektionen auf eine große Anzahl neokortikaler Ziele projizieren, von denen viele Schmerzen und Überempfindlichkeit auf vielfältige Weise beeinflussen, versuchten wir anschließend, die Bedeutung neuronaler NBM-Projektionen auf den medialen präfrontalen Kortex (mPFC) zu untersuchen, der einen wichtigen Knotenpunkt im Gehirn darstellt Schaltkreise, die dem Schmerz zugrunde liegen. Das mPFC unterliegt bei mehreren klinischen chronischen Schmerzzuständen beim Menschen einer deutlichen Plastizität, und insbesondere hat sich ein Hauptaugenmerk auf seine bei einigen Patienten mit chronischen Schmerzen beobachtete Deaktivierung gelegt15, ein Befund, der auch in Tiermodellen für neuropathische Schmerzen berichtet wird16,17,18,19. Wir exprimierten daher ChR2-YFP in ChAT-Neuronen des NBM und platzierten die optische Faser für die Blaulichtbeleuchtung im prälimbischen Kortex (PL), dem Maus-Gegenstück zum menschlichen mPFC (Abb. 5a). Die selektive Aktivierung cholinerger NBM-Projektionen auf den PL hatte keinen Einfluss auf die mechanische Grundempfindlichkeit, hatte jedoch eine noch stärkere analgetische Wirkung als die direkte Aktivierung von NBM-Neuronen bei CFA-induzierter mechanischer Überempfindlichkeit, die sich vollständig auf die Grundwerte umkehrte (Abb. 5b). Darüber hinaus wurde die thermische Überempfindlichkeit bei Mäusen über einen langen Zeitraum nach CFA durch optogenetische Stimulation der NBM-PL-Projektionen signifikant unterdrückt (Abb. 5c).

a–c Schema zur optogenetischen Stimulierung cholinerger-GABAerger NBM-PL-Projektionen und ihre Auswirkung auf entzündliche mechanische (Tag 2; b) und Hitzeüberempfindlichkeit (c); Die P-Werte im Einschub (b) stellen einen ANOVA-basierten Vergleich der beiden gesamten Reiz-Reaktions-Kurven dar. n = 6 ChAT-Cre- und 11 ChAT-Cre+-Mäuse; P < 0,05 (*0,0043, rechtes Feld in b; *,# < 0,0001 für CFA-Tage 3 und 8 in (c)), Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. d Schema der Konnektivität zwischen cholinergen-GABAergen NBM-Projektionen, erregenden Afferenzen und verschiedenen PL-Neuronen, die über nikotinische und muskarinische cholinerge Signale das Feuern von PL-Pyramidenneuronen beeinflussen. IN GABAerges Interneuron, PN Pyramidenneuron; Arten von GABAergen Interneuronen: PV-Parvalbumin-Typ, SOM-Somatostatin-Typ, VIP-Vasoaktives Darmpeptid-Typ. e Beispielbilder der Anti-YFP-Immunhistochemie, die NBM-Projektionen auf den PL (Vergrößerung nach rechts) und angrenzende Kortizes (links: verschiedene hochauflösende konfokale Felder zusammengefügt) zeigen. Maßstabsbalken = 250 µm (links) und 100 µm (rechts). f–h Fos-Quantifizierung aller PL-Schichten oder Schicht 5 (f) und in erregenden Projektionsneuronen (SATB2- oder Ctip2; g) und inhibitorischen Neuronen (PV oder SOM; h) als Reaktion auf optogenetische Stimulation von NBM-PL cholinerg-GABAergisch Projektionen (dargestellt durch Cre+-Mäuse) oder Kontrolle (dargestellt durch Cre--Mäuse) (alle Mäuse sind „Laser AN“). N = 5 Mäuse/Gruppe für Panel f–h; *P < 0,05 (alle Schichten: 0,0091, Schein, <0,0001, CFA; Schicht 5: 0,0036, Schein, <0,0001, CFA), Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von einem Post-hoc-Sidak-Test für f und einem ungepaarten zweiseitigen t-Test für g (P = 0,0166, für SATB2 & 0,0066 für Ctip2) und h. In g, h sind nur Mäuse dargestellt, denen CFA injiziert wurde. i Entzündliche mechanische Überempfindlichkeit bei Rbp4-Cre-Mäusen, die das exzitatorische DREADD, hm3D(Gq), in Cre-abhängiger Weise exprimieren. n = 8 Mäuse/Gruppe; *P < 0,05 (0,0019, 0,0019, 0,0002 für 0,07, 0,16 bzw. 0,4 g Filamente), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Elektrophysiologische Studien und Modellierungsstudien weisen darauf hin, dass cholinerge Eingaben aus dem basalen Vorderhirn direkte erregende Wirkungen über rezeptorvermittelte Signale auf kortikale Pyramidenneuronen ausüben und auch die Fähigkeit haben, über Signale auf verschiedenen Klassen lokaler neokortikaler GABAerger Interneurone entweder Hemmung oder Enthemmung von Pyramidenneuronen hervorzurufen über die Signalübertragung über verschiedene Arten von Nikotin- und Muskarinrezeptoren14,20. Interessanterweise deuten neuere Studien auch darauf hin, dass GABA aus cholinergen Projektionen, die aus den basalen Vorderhirnkernen stammen, gemeinsam freigesetzt wird und somit neokortikale Pyramidenneuronen durch Unterdrückung lokaler inhibitorischer Interneurone enthemmen kann (Schema in Abb. 5d). Es wurde vermutet, dass beide Mechanismen dazu beitragen, die kortikale Signal-Rausch-Verarbeitung sensorischer Eingaben zu verbessern, z. B. visuelle Eingaben im visuellen Kortex und taktile Eingaben im somatosensorischen Kortex21. Um zu untersuchen, wie sich cholinerge-GABAerge NBM-PL-Projektionen auf die PL auswirken, haben wir in Verbindung mit der Optogenetik eine schichtübergreifende Virusverfolgung und c-Fos-Kartierung durchgeführt. Während sich NBM-Projektionen auf den größten Teil des neokortikalen Mantels diffus über alle kortikalen Schichten erstrecken, ergaben unsere Verfolgungsanalysen interessanterweise, dass Projektionen vom NBM zum PL im Vergleich zu anderen Schichten besonders häufig in Schicht 5 enden (Abb. 5e; vergleiche mit benachbarten Schichten). motorischer Kortex M2 und cinguläre kortikale Domänen). Sowohl bei Ausgangsbedingungen (naive Mäuse) als auch bei Mäusen mit entzündlichem, schmerzähnlichem Verhalten führte die optogenetische Stimulation der NBM-PL-Projektionen zu einem signifikanten Anstieg der Fos-Spiegel im gesamten PL, einschließlich Schicht 2/3, Schicht 5 und Schicht 6 (Abb. 5f und ergänzende Abb. 4a; alle Datenpunkte repräsentieren „Laser EIN“-Bedingungen). Fos-exprimierende PL-Neuronen nahmen bei einer Pfotenentzündung im Vergleich zu den Ausgangswerten bei allen Mäusen zu; Die optogenetische Aktivierung von NBM-PL-Verbindungen in ChR2-exprimierenden Mäusen erhöhte jedoch die Anzahl der Fos-exprimierenden PL-Neuronen in CFA-injizierten Mäusen über den durch die Entzündung induzierten Anstieg hinaus (Abb. 5f und ergänzende Abb. 4a; alle Datenpunkte stellen „Laser“ dar). EIN"-Bedingungen). Anschließend führten wir eine detaillierte Charakterisierung der Natur von Fos+-Neuronen in CFA-injizierten Mäusen durch, wobei wir Anti-SATB2-Antikörper zur Markierung erregender Neuronen verwendeten, die eine relative Präferenz für Assoziationsneuronen zeigen, die intratelenzephal zu anderen neokortikalen Bereichen projizieren22, und Anti-Ctip2-Antikörper zur Markierung erregende Neuronen, die subkortikal projizieren23, und Anti-Parvalbumin- und Anti-Somatostatin-Antikörper zur Markierung der beiden häufigsten Populationen GABAerger Neuronen11. Wir beobachteten, dass die optogenetische Stimulation der NBM-PL-Projektionen die Fos-Aktivierung sowohl in SATB2- als auch in Ctip2-Populationen erregender Projektionsneuronen verstärkt (Abb. 5g), die Aktivität GABAerger Neuronen in der PL jedoch nicht verändert (Abb. 5h). Jüngste Studien haben gezeigt, dass ein wichtiger Output des PL aus Pyramidenneuronen der Schicht 5 im PL besteht, die zum periaquäduktalen Grau projizieren und dadurch eine Verbindung zu absteigenden nozizeptiven Modulationssystemen herstellen24. Wir stimulierten daher selektiv Schicht-5-Neuronen chemogenetisch, indem wir die hM3D(Gq)-Expression25 in der Schicht-5-spezifischen Rbp4-Cre-Linie viral steuerten, und beobachteten, dass die selektive Verstärkung der Schicht-5-Ausgänge in der PL die antihyperalgetische Wirkung der NBM-PL-Stimulation auf mechanische Allodynie nachahmt Mäuse mit CFA, während die Grundempfindlichkeit nicht verändert wurde (Abb. 5i, linkes Feld; mCherry-Expression wurde als Kontrolle verwendet, Abb. 5i, rechtes Feld).

Unter dem Gesichtspunkt der translationalen Relevanz ist es wichtig zu untersuchen, ob die gezielte Behandlung des cholinergen NBM-Systems auch bei anderen Schmerzformen, insbesondere bei neuropathischen Schmerzen, von Vorteil ist. Daher untersuchten wir, ob das cholinerge NBM-System im neuropathischen Schmerzzustand rekrutiert wird und mit mechanischer Allodynie zusammenhängt, indem wir die Fos-Expression in Abwesenheit oder bei plantarer Anwendung einer mechanischen von Frey-Kraft geringer Intensität untersuchten, die unter Ausgangsbedingungen harmlos ist. Die Fos-Expression im NBM war bei neuropathischen Mäusen im Vergleich zu scheinverletzten Mäusen signifikant erhöht und zeigte einen weiteren Anstieg bei Pfotenstimulation im Zusammenhang mit mechanischer Allodynie (Abb. 6a, b). Wichtig ist, dass sich dies auch in ChAT-exprimierenden cholinergen Neuronen widerspiegelte (Abb. 6a, b), was auf eine verstärkte Rekrutierung durch Reize hindeutet, die unter Ausgangsbedingungen harmlos sind, bei neuropathischen Schmerzzuständen jedoch als schädlich empfunden werden, was Parallelen zu unseren Ergebnissen in elektrophysiologischen Experimenten zeigt im oben beschriebenen entzündlichen Schmerzmodell.

a, b Typische Beispiele und quantitative Zusammenfassung der Expression des Aktivitätsmarkers Fos in cholinergen Neuronen (ChAT-exprimierend) des NBM bei naiven Mäusen und Mäusen mit chronischer Konstriktionsnervenverletzung (CCI) in Gegenwart oder Abwesenheit einer schwachen Intensität ( 0,16 g) mechanischer Reiz an der kontralateralen Hinterpfote. Maßstabsbalken = 50 µm; n = 4 Mäuse/Gruppe; P < 0,05 (*0,0168, #0,0065), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstests. c, d Schema zur chemogenetischen Aktivierung cholinerger NBM-Neuronen, die hm3D(Gq) exprimieren, mit Clozapin-N-oxid (CNO; c) und Validierung seiner Wirksamkeit bei der Erhöhung der Fos-Expression im Vergleich zu Mäusen, die mCherry in cholinergen Neuronen exprimieren (Kontrolle; d). dn = 3 Mäuse/Gruppe. e–g Vergleich von Capsaicin-induzierten nozifensiven Reaktionen (e) und der Entwicklung von CCI-induzierter mechanischer Überempfindlichkeit (f) oder thermischer Überempfindlichkeit (g) zwischen Mäusen mit chemogenetischer Aktivierung von cholinergen NBM-Neuronen und Kontrollmäusen (mCherry). Die P-Werte im Einschub (f) stellen einen ANOVA-basierten Vergleich der beiden gesamten Reiz-Reaktions-Kurven dar. n = 5 Schein- und 6 hM3D(Gq)-Mäuse; *P < 0,05 (0,0121 in e; 0,0178 & 0,0231, CCI Tag 7; 0,0151 & 0,0165, CCI Tag 11; 0,0209 CCI Tag 28 in f; <0,0001, CCI Tag 4; 0,010, CCI Tag 14 in g), zwei- Weg-ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Um die funktionelle Bedeutung dieser Ergebnisse im Zusammenhang mit neuropathischen Schmerzzuständen zu testen, verwendeten wir einen chemogenetischen Ansatz zur Aktivierung cholinerger Neuronen des basalen Vorderhirns, der zwei Vorteile bot: Erstens ermöglichte er die gezielte Behandlung eines größeren Bereichs als die optogenetische Stimulation (die begrenzt ist). (aufgrund der maximalen Fläche, die ausreichend beleuchtet werden kann), und zweitens ermöglichte es eine länger anhaltende Aktivierung cholinerger Neuronen. ChAT-Cre-Transgenen wurde rAAV injiziert, das entweder den exzitatorischen chemogenetischen Aktor (mcherry-markiertes hM3D(Gq)) oder das Kontrollprotein (mCherry) in Cre-abhängiger Weise exprimierte, und mit Clozapin-N-Oxid behandelt, was eine induzierbare Aktivierung von hM3D( Gq)25 (Abb. 6c). Die duale Immunhistochemie für ChAT und Fos zeigte, dass 77 % der cholinergen Neuronen im NBM hM3D(Gq) exprimierten und 74 % eine Fos-Expression bei CNO-Behandlung zeigten, während weniger als 5 % eine Fos-Expression in Abwesenheit von CNO zeigten (Abb. 6d). Dadurch wurde die Wirksamkeit und Spezifität der chemogenetischen Aktivierung von cholinergen NBM-Neuronen validiert. In Übereinstimmung mit Daten aus optogenetischen Experimenten beobachteten wir, dass sich die nozizeptive Grundempfindlichkeit gegenüber mechanischem Druck und Hitze nicht veränderte; Allerdings wurde das durch die plantare Injektion von Capsiacin induzierte tonische schmerzähnliche Verhalten durch die chemogenetische Aktivierung cholinerger Neuronen signifikant reduziert (Abb. 6e – g).

Anschließend verwendeten wir das Modell der chronischen Konstriktionsverletzung (CCI), das eine einseitige lockere Unterbindung des Ischiasnervs beinhaltete, was zu einer lokalen Entzündung und Schwellung des Nervs, Neuropathie und nozizeptiver Überempfindlichkeit führte, die bis zu einem Monat anhielt26. Die durch CCI induzierte mechanische Überempfindlichkeit war bei hM3D(Gq)-exprimierenden Mäusen im Vergleich zu mCherry-exprimierenden Mäusen ab Tag 4 nach der CCI-Operation deutlich reduziert (Abb. 6f). Am 11. Tag waren die mechanischen Reaktionen bei hM3D(Gq)-exprimierenden Mäusen nicht von der Grundempfindlichkeit zu unterscheiden, während mCherry-exprimierende Mäuse weiterhin mechanische Überempfindlichkeit zeigten und erst am 28. Tag wieder die Grundwerte erreichten (Abb. 6f). In ähnlicher Weise war die Hitzeüberempfindlichkeit bei hM3D(Gq)-exprimierenden Mäusen im Vergleich zu mCherry-exprimierenden Mäusen bis zum 14. Tag nach der CCI signifikant verringert (Abb. 6g). Diese Daten zeigen, dass die Aktivierung des NBM die neuropathische Überempfindlichkeit über einen langen Zeitraum unterdrückt.

Die Aktivität von NBM-Neuronen hat das Potenzial, die Schmerzverarbeitung direkt über cholinerge Signale in neokortikalen Zielen zu beeinflussen, die für Schmerznetzwerke wichtig sind, wie unsere obigen Beobachtungen zu Neuronen der präfrontalen Schicht 5 zeigen. Da jedoch bekannt ist, dass das NBM ein wichtiger Modulator der Schaltkreise ist, die Erregung und Aufmerksamkeit zugrunde liegen20, besteht auch die Möglichkeit, dass die beobachteten antihyperalgetischen Wirkungen mit Aufmerksamkeit und Erwartung zusammenhängen. Wir untersuchten daher auch, ob die optogenetische Stimulation von cholinergen NBM-Neuronen das Aufmerksamkeitsverhalten beeinflusst, indem wir den weithin akzeptierten Fünf-Wahl-Serienreaktionsaufgabentest (5-CSRT; Abb. 7a) unter den gleichen Bedingungen verwendeten, die bei Mäusen angewendet wurden, die in den Experimenten für nozizeptive Tests verwendet wurden beschrieben in Abb. 4–6. Über einen Zeitraum von drei Wochen wurden wassergebundene Mäuse darauf trainiert, operante Konditionierungsaufgaben zu erlernen, um richtige Entscheidungen zu treffen und eine Wasserbelohnung zu erhalten (Abb. 7a). Die chemogenetische Stimulation cholinerger NBM-Neuronen steigerte die Genauigkeit der Reaktionen erheblich und verringerte die Rate der Auslassungen, was auf ein höheres Aufmerksamkeitsniveau hindeutet (Abb. 7b). Als wir jedoch NBM-PL-Projektionen unter den gleichen Bedingungen, die bei der Analyse des schmerzähnlichen Verhaltens angewendet wurden, optogenetisch stimulierten, gab es keinen signifikanten Einfluss auf die Genauigkeit der Reaktionen und die Auslassungsrate (Abb. 7c und ergänzende Abb. 5a). b), was darauf hindeutet, dass die Manifestation des antihyperalgetischen Verhaltens nicht per se mit Aufmerksamkeitsänderungen zusammenhängt. Es ist jedoch plausibel, dass in den Experimenten im Zusammenhang mit NBM-PL-Projektionen aufgrund eines Deckeneffekts unter Ausgangsbedingungen eine potenzielle Verbesserung der Aufmerksamkeit übersehen wurde, und die Situation kann bei einem Schmerzzustand, der mit eingeschränkter Aufmerksamkeit einhergeht, anders sein. Wir testeten daher Mäuse mit entzündlichem, schmerzähnlichem Verhalten im 5-CSRT-Test und beobachteten, dass alle Mäuse bis zu 3 Tage nach der CFA einen signifikanten Anstieg der Auslassungsrate im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen zeigten (Abb. 7d). Die optogenetische Aktivierung von NBM-PL-Projektionen bei diesen Mäusen rettete jedoch nicht die anhaltenden schmerzbedingten Aufmerksamkeitsdefizite (Abb. 7d und ergänzende Abb. 5c) und die CFA-induzierte Beeinträchtigung blieb bestehen, unabhängig davon, ob die Laserstimulation eingeschaltet war (Abb. 7d). oder aus (ergänzende Abbildung 5c) sowohl bei ChAT-Cre- als auch bei Cre-negativen Kontrollmäusen, was weiter darauf hindeutet, dass NBM-PL-Projektionen unabhängig von der Aufmerksamkeitsmodulation Analgesie induzieren.

ein Schema zum Trainieren von Mäusen in aufmerksamkeitsbezogenen Aufgaben im 5-Choice Serial Reaction Task-Test (5-CSRT). b, c Erhöhte aufmerksamkeitsbezogene Parameter bei Mäusen mit chemogenetischer Aktivierung cholinerger Neuronen im NBM (b), jedoch nicht bei Mäusen mit optogenetischer Aktivierung der cholinergen NBM-Projektionen zum PL (c). n = 10 Mäuse/Gruppe (b); n = 6 ChAT-Cre- und 8 ChAT-Cre+-Mäuse (c); *P < 0,05 (Auslassungsversuche 0,0259; Genauigkeit 0,0008), gepaarter zweiseitiger t-Test. d Veränderungen im Aufmerksamkeitsverhalten bei Induktion von entzündlichem, schmerzähnlichem Verhalten nach CFA-Injektion in die Hinterpfote im Vergleich zum Ausgangsverhalten bei Blaulichtstimulation von cholinergen NBM-PL-Projektionen bei ChAT-Cre+-Mäusen und Cre-Kontrollmäusen. N = 9 ChAT-Cre- und 10 ChAT-Cre+-Mäuse; *P < 0,05 (Cre-, 0,0068; Cre+, <0,0001), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. e–g Analyse von angstbezogenem Verhalten (oben in e, f, g) und Fortbewegung (unten in e, f, g) im Freilandtest bei Mäusen mit chemogenetischer (e) oder optogenetischer (f) Aktivierung cholinerger Wirkung Neuronen im NBM oder Mäuse mit optogenetischer Aktivierung der cholinergen NBM-Projektionen zum PL (g) im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen. n = 6 mCherry- und 8 hm3D(Gq)-Mäuse (e); n = 7 ChAT-Cre- und 8 ChAT-Cre+-Mäuse (f); n = 6 Mäuse/Gruppe (g); *P < 0,05 (0,0182 für Angstscore in g), zweifaktorielle ANOVA mit Sidaks Mehrfachvergleichstest. Die Daten werden als Mittelwert +/− SEM dargestellt.

Zweitens erhält das NBM direkte Eingaben vom CeA und ist mit neuronalen Schaltkreisen für Angst und Furcht verbunden27. Wir beobachteten, dass weder eine direkte chemogenetische (Abb. 7e) noch optogenetische Stimulation von NBM-Neuronen (Abb. 7f) angstassoziiertes Verhalten im Freilandtest hervorrief (das Verhältnis von Mitte zu Rand blieb unverändert). Im Gegensatz dazu verringerten optogenetisch stimulierende NBM-PL-Projektionen das Verhältnis von Mitte zu Rand bei naiven Mäusen, was auf anxiolytische Effekte schließen lässt (Abb. 7g). Schließlich blieb die Fortbewegung in allen Gruppen mit optogenetischer oder chemogenetischer Modulation der NBM- oder NBM-PL-Schaltkreise unverändert, was darauf hindeutet, dass in Verhaltensanalysen keine störenden Auswirkungen auf die motorische Funktion auftreten (Abb. 7e – g).

Es gibt überraschend wenig Literatur zum basalen cholinergen Kern des Vorderhirns und zur Schmerzwahrnehmung. Bisher haben weniger als eine Handvoll Studien die Aktivität des basalen cholinergen Kerns des Vorderhirns bei schädlicher Stimulation getestet28,29. In dieser Studie berichten wir nun über die genaue Natur der Oszillationsrhythmen im NBM sowie über eine detaillierte Analyse auf Einzelzellebene in vivo und zeigen, dass das NBM nicht nur auf schädliche Reize reagiert, sondern während des Übergangs auch dynamische Veränderungen erfährt zu einem chronischen schmerzähnlichen Zustand. Die interessanteste Beobachtung war, dass die Kraft der Gamma-Oszillationsaktivität im NBM insbesondere in Verbindung mit schädlicher Stimulation vor der Verhaltensreaktion verstärkt wird. Gamma-Oszillationen im S1 wurden funktionell mit der nozizeptiven Modulation sowohl im menschlichen als auch im Nagetiersystem in vivo in Verbindung gebracht30,31, und diese schmerzbedingten Veränderungen der Gammaaktivität wurden erst kürzlich auf andere Neokortizes, wie den präfrontalen und den Inselkortizes, ausgeweitet9,32 ,33. Nach unserem besten Wissen stellt diese Studie den ersten Bericht dar, der Gammarhythmen in einer subkortikalen Struktur mit nozizeptiver Empfindlichkeit in Verbindung bringt. Diese wurden in Humanstudien aufgrund technischer Einschränkungen bei Kopfhautaufzeichnungen wahrscheinlich übersehen.

Wichtig ist, dass unsere Beobachtung, dass in einem entzündlichen Schmerzmodell die Kraft der Gammaaktivität als Reaktion auf nicht schädliche taktile Stimulation verstärkt wird, mit der Manifestation mechanischer Allodynie korreliert und ähnliche Beobachtungen im S1-Kortex nachahmt31. Zusammen mit dem aktuellen Wissensstand besteht eine verlockende Schlussfolgerung aus unseren Erkenntnissen darin, dass die Gammaaktivität im NBM über cholinerge Bahnen funktionell mit neokortikalen Gammaoszillationen während der nozizeptiven Verarbeitung verknüpft ist. Dies wird durch mehrere konzeptionelle Punkte und experimentelle Beobachtungen gestützt. Erstens berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie an Ratten über hämodynamische Blutflussänderungen im NBM nach schädlicher Stimulation und zeigte, dass durch schädliche Stimulation hervorgerufene Änderungen des zerebralen Blutflusses im ipsilateralen S1-Kortex bei Läsion des NBM34 signifikant verringert wurden, was auf die Bedeutung des NBM im NBM hindeutet vollständige Manifestation schmerzbezogener Reaktionen im somatosensorischen Kortex. Zweitens erleichtert oder löst die cholinerge Signalübertragung sowohl in S1 als auch im präfrontalen Kortex die Gammaband-Oszillationsaktivität über die Modulation lokaler GABAerger Interneurone35,36 direkt aus, wodurch die Schärfe der Reizverarbeitung in sensorischen und Aufmerksamkeitsnetzwerken verbessert wird, obwohl diese Phänomene nicht aufgetreten sind bisher im Zusammenhang mit Schmerzen angesprochen. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die Gamma-Oszillationsaktivität Aktivitätszustände über entfernte Orte im Gehirn hinweg koordiniert und verknüpft, was im Zusammenhang mit Schmerzen ein besonders bemerkenswertes Konzept darstellt8, da es sich bei Schmerzen im Wesentlichen um eine Netzwerkfunktion handelt37,38.

Eine herausragende Rolle bei der Entstehung der Gamma-Oszillationsaktivität wird den schnell ansteigenden GABAergen Interneuronen zugeschrieben, die über Gap Junctions umfassend miteinander verbunden sind; Sie rationalisieren und synchronisieren nicht nur den erregenden Output innerhalb einer Region, sondern sind auch dazu in der Lage, dies an entfernten Orten über weitreichende GABAerge Projektionen zu tun, die typischerweise mit GABAergen Neuronen synapsieren und so zu einer Enthemmung führen8,11. Wichtig ist hier, dass wir beobachteten, dass, während verschiedene Sätze von NBM-Neuronen bei nozizeptiver Stimulation Erregung oder Hemmung zeigten, die NBM-Neuronen, die während des Übergangs zur nozizeptiven Überempfindlichkeit signifikante Veränderungen durchmachten, aus der Wellenformanalyse abgeleitet wurden, dass es sich um schnell ansteigende GABAerge Neuronen handelte. Im NBM ist die überwiegende Mehrheit der cholinergen Neuronen GABAergisch11 und diese umfassen weitreichende Projektionen zum neokortikalen Mantel, was den Zusammenhang zwischen den Ursprüngen der Gamma-Oszillationsaktivität im NBM und der kortikalen Schmerzmodulation weiter untermauert. Wir beobachteten auch Veränderungen im Beta-Frequenzbereich der Oszillationsaktivität; Über seinen zellulären Ursprung und seine funktionelle Bedeutung für den Schmerz ist jedoch viel weniger bekannt. Studien an gesunden Probanden haben gezeigt, dass die Aktivität in den Niederfrequenzbändern, insbesondere im Alpha- und Betabereich, im S1-, präfrontalen und Inselkortizes in Korrelation mit subjektiven Schmerzbewertungen unterdrückt wird9,39. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Bedeutung von Beta-Rhythmus-Änderungen im NBM bei Schmerzzuständen zu entschlüsseln und zu klären, ob und wie diese zu Veränderungen der Beta-Oszillationen im Neokortex beitragen.

Unsere Analysen mit dem aktivitätsinduzierten unmittelbar frühen Genprodukt Fos legen nahe, dass cholinerge Neuronen des NBM zunehmend bei entzündlichen und neuropathischen Schmerzzuständen rekrutiert werden, insbesondere in Verbindung mit sensorischer Stimulation. Dieser Befund sowie das oben diskutierte allgemeine Funktionsprofil cholinerger NBM-Neuronen könnten gleichermaßen für eine Rolle des NBM bei der pro-nozizeptiven oder antinozizeptiven Modulation sprechen. Hier zeigten zwei unabhängige Aktivierungsmodi cholinerger NBM-Neuronen, dass das Nettoergebnis ihrer Aktivierung darin besteht, nozizeptive Überempfindlichkeit zu unterdrücken. Eine frühere Studie über großflächige Schäden an cholinergen Neuronen unter Verwendung von konjugiertem Saporin, das über intrazerebroventrikuläre Injektionen verabreicht wurde, berichtete über eine verringerte freiwillige Flucht sowohl vor schädlicher Hitze als auch stressigen Geräuschen, ohne dass sich das nozifensive Verhalten der Wirbelsäule änderte, und kam zu dem Schluss, dass Affektverhalten, nicht aber sensorisches Verhalten durch moduliert werden cholinerge Neuronen des Vorderhirns40; Diese Schlussfolgerungen basierten jedoch auf einer weit verbreiteten Ablation im gesamten Gehirn, parenchymaler Toxizität und einem Verlust der Konnektivität zu einer großen Anzahl von Bereichen, einschließlich Hippocampus, Amygdala und Kortex. Hier deuten zellspezifische und reversible Manipulationen der Aktivität und nicht der neuronalen Integrität, die auf das NBM beschränkt waren, darauf hin, dass die Rekrutierung cholinerger NBM-Neuronen eine insgesamt schützende Rolle bei der Begrenzung des wahrgenommenen Schmerzes spielt. Da NBM-Neuronen auf verschiedene neokortikale Domänen mit unterschiedlichen Funktionen sowie auf die Amygdala projizieren, kann nicht ausgeschlossen werden, dass einzelne Verbindungen unterschiedliche Rollen spielen. In diesem Sinne berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, die sich mit einem anderen cholinergen Kern, nämlich dem medialen Septumkern, befasste, dass sowohl Hemmung als auch Aktivierung paradoxerweise zur Unterdrückung von schmerzähnlichem Verhalten führten, indem sie gegensätzliche Auswirkungen auf den rostralen anterioren cingulären Kortex und den ventralen Hippocampus CA1 hatten Region41. Hier lieferte die spezifische Aktivierung von NBM-Projektionen auf den PL-Kortex ein eindeutiges Argument für eine antinozizeptive Funktion, die mit der Beobachtung einer dichteren Ausrichtung afferenter Projektionen auf Schicht 5 und einer verstärkten Fos-Expression in Schicht-5-Pyramidenneuronen des PL einherging. Als weitere Unterstützung liefern wir Beweise dafür, dass die Steigerung der Leistung von PL-Neuronen der Schicht 5 durch optogenetische Stimulation ein ähnliches antinozizeptives Ergebnis hat wie die Stimulation von NBM-PL-Verbindungen. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der PL in einem entzündlichen schmerzähnlichen Zustand eine erhöhte Aktivität zeigt, was mit einer erhöhten Oszillationsaktivität im NBM bei entzündlichen Schmerzen übereinstimmt. Wichtig ist, dass die Aktivität erregender PL-Neuronen, nicht jedoch inhibitorischer Neuronen, durch die Aktivierung des NBM-PL-Signalwegs weiter gesteigert wird. Diese Eigenschaft könnte von klinischer Relevanz sein, da über eine Deaktivierung des PL bei einigen Arten chronischer Schmerzpatienten15,19 sowie bei neuropathischen Schmerzmodellen bei Nagetieren16,17,18,19 berichtet wurde. In Modellen für neuropathische Schmerzen wurde gezeigt, dass die Verbesserung der PL-Ausgabe, entweder optogenetisch24,42, pharmakologisch43 oder über nicht-invasive transkranielle Hirnstimulation44, eine Analgesie hervorruft. Tatsächlich sind die Mechanismen, die der Deaktivierung des präfrontalen Kortex bei chronischen Schmerzen zugrunde liegen, ein Thema von großem aktuellem Interesse, wobei Studien eine verstärkte Feedforward-Hemmung durch Potenzierung von Amygdalar-Inputs auf schnell ansteigende GABAerge Neuronen bei neuropathischen Schmerzen belegen17,24. Im Gegensatz dazu haben eingehende cholinerge Afferenzen aus dem NBM, von denen bekannt ist, dass sie gleichzeitig GABA freisetzen, die Fähigkeit, neokortikale Pyramidenneuronen durch direkte Modulation bzw. Modulation lokaler GABAerger Neuronen sowohl zu hemmen als auch zu enthemmen. Unsere Ergebnisse zeigen nun, dass cholinerge-GABAerge Projektionen des NBM auf den PL dazu dienen, die PL-Aktivität durch eine erhöhte Aktivierung erregender Projektionsneuronen zu steigern, was dazu beitragen könnte, einer Deaktivierung des PL bei neuropathischen Schmerzzuständen entgegenzuwirken. Zur Unterstützung gibt es Belege aus einer Ex-vivo-Studie, die eine Verringerung der synaptischen Expression exzitatorischer M1-Muskarinrezeptoren in Schicht-5-Neuronen des PL bei neuropathischen Mäusen zeigt45, und eine Studie, die über die Unterdrückung neuropathischer Allodynie bei Anwendung eines M1–M4-Agonisten im Vorderbereich berichtet cingulärer Kortex46. In zukünftigen Studien wird es interessant sein, die relativen Beiträge von GABA und Acetylcholin, die von NBM-PL-Afferenzen gemeinsam freigesetzt werden, bei der Modulation der Aktivität des PL, z. B. über die regionale Abgabe pharmakologischer Agonisten und Antagonisten, zu untersuchen.

Da das NBM verschiedene unterschiedliche Funktionen erfüllt, ist es wichtig, unsere Schlussfolgerungen durch alternative Interpretationen zu mildern. Die Modulation der Aufmerksamkeit ist eine der am besten untersuchten Funktionen des NBM20, was in dieser Studie an Mäusen, die eine direkte optogenetische Stimulation der cholinergen neuronalen NBM-Somata erhielten, tatsächlich bestätigt wurde. Es wurde vermutet, dass die Aufmerksamkeit die Schmerzwahrnehmung tiefgreifend moduliert, z. B. durch Veränderung der absteigenden Modulation oder im Sinne einer Verstärkung der Schmerzwahrnehmung durch Hypervigilanz47,48, was es möglich macht, dass Aufmerksamkeitsfaktoren bei der Schmerzmodulation durch das NBM eine Rolle spielen. Die selektive Aktivierung cholinerger NBM-Projektionen auf den PL reichte jedoch nicht aus, um Aufmerksamkeit und Motivation zu modulieren, und ist daher wahrscheinlich nicht vollständig für Veränderungen im nozifensiven Verhalten verantwortlich. Stattdessen würde die verstärkte Aktivierung von Schicht-5-PL-Neuronen durch afferenten cholinergen-GABAergen NBM-Input es plausibler machen, dass die bekannte direkte Konnektivität von Schicht-5-Pyramidenneuronen mit dem PAG18,24 zu einer absteigenden Modulation der Nozizeption führt. Die motorische Aktivität oder die Gesamtaktivität blieben unverändert, was darauf hindeutet, dass die beobachteten analgetischen Wirkungen unabhängig von Erregung und motorischer Dysfunktion waren. Die möglichen anxiolytischen Wirkungen, die bei der Stimulierung von NBM-PL-Projektionen beobachtet werden, sind interessant, da sie insbesondere bei der Bekämpfung von Angst als Komorbidität pathologischer Schmerzen vielversprechend sein könnten49.

Insgesamt unterstützen die Ergebnisse dieser Studie weitere Untersuchungen zum Einsatz der cholinergen Modulation in der Schmerzbehandlung. Während in präklinischen Modellen gezeigt wurde, dass Medikamente, die auf cholinerge Rezeptoren abzielen, wirksam sind, erschwert die große Bandbreite an Nebenwirkungen eine klinische Anwendung. Inhibitoren der Acetylcholinesterase wie Rivastigmin und Neostigmin, die die Bioverfügbarkeit dieses Neurotransmitters an den Stellen erhöhen, an denen er physiologisch freigesetzt wird, haben in einer Reihe von Studien bei Schmerzen klinische Wirksamkeit gezeigt3,50. Es ist daher unbedingt erforderlich, die Wirkungsorte und Veränderungen in den Schaltkreisen bei chronischen Schmerzen abzugrenzen, die im Hinblick auf vorteilhafte Wirkungen am vielversprechendsten sind und gleichzeitig weniger Nebenwirkungen hervorrufen. Mithilfe modernster In-vivo-Elektrophysiologie und spezifischer Schaltkreismanipulationen zeigt diese Studie, dass das NBM ein wichtiger Modulator der Schaltkreise ist, die an der Schmerzwahrnehmung beteiligt sind, und dass die NBM-Aktivität oder ihre Projektionen auf den PFC direkt verstärkt werden, z. B. durch neuartige Designs in Neurostimulationstechniken. ist vielversprechend bei der Behandlung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzerkrankungen. In diesem Sinne ist es bemerkenswert, dass die NBM bereits als potenzieller Wirkort von Vollnarkosemedikamenten in Betracht gezogen wurden51.

Die gezielte Behandlung des NBM kann auch im Zusammenhang mit anderen Aspekten chronischer Schmerzen, die in dieser Studie nicht behandelt wurden, therapeutisch vielversprechend sein. Chronische Schmerzzustände gehen beispielsweise häufig mit Schlafstörungen einher, die pathogen sind und ihre Prognose und das Ansprechen auf die Behandlung verschlechtern52,53. Es hat sich gezeigt, dass Schlafentzug zu einer verminderten Konnektivität des NBM mit dem präfrontalen Kortex führt54. Darüber hinaus wurde über neuronalen Verlust im NBM bei Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit und der Parkinson-Krankheit sowie im Alter55,56,57,58 berichtet. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass eine neuronale Depletion im NBM wahrscheinlich zu einem Verlust zentraler antinozizeptiver modulatorischer Wirkungen führt und dadurch zu Schmerzstörungen beiträgt, die häufig mit diesen Zuständen einhergehen. In diesem Zusammenhang ist auch unsere Beobachtung einer Verringerung der NBM-Aktivität in sehr späten Stadien nach einer Pfotenentzündung interessant. Die laufende Entwicklung und Erprobung der Tiefenhirnstimulation des NBM56,58 verspricht daher nicht nur, den kognitiven Rückgang zu reduzieren, sondern auch Schmerzen zu unterdrücken und den normalen Schlaf bei diesen Störungen wiederherzustellen.

Die Experimente wurden an männlichen und weiblichen 2 bis 8 Monate alten heterozygoten Chat-IRES-Cre-Mäusen (B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl//Uhg59;) mit einem C57BL/6-Hintergrund durchgeführt und hier als ChAT-Cre bezeichnet Mäuse. Für Kontrollexperimente wurden Cre-(negative) Wurfgeschwister verwendet. Zwei bis vier Monate alte männliche und weibliche Rbp4-Cre-Tiere (B6.FVB/CD1-Tg(Rbp4cre)KL100Gsat/Uhg) mit einem C57BL/6-Hintergrund wurden für das chemogenetische Targeting von Schicht-5-Pyramidenneuronen im prälimbischen Kortex verwendet. Männliche und weibliche C57BL/6J-Tiere im Alter von 8–20 Wochen wurden von Janvier Labs gekauft. Die Tiere wurden mit Futter und Wasser ad libitum in einem 12-Stunden-Licht-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus gehalten. Die ARRIVE-Richtlinien wurden befolgt. Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den ethischen Richtlinien der örtlichen Regierungsbehörde (Regierungspräsidium Karlsruhe, Deutschland; Genehmigungsnummern 35-9185.81/G44/17 und 35-9185.81/G184/18) durchgeführt.

Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Fentanyl (0,01 mg/kg), Medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg) und Midazolam (4 mg/kg) tief anästhesiert. Lidocain (10 %) wurde auf die Hautoberfläche aufgetragen und über der interessierenden Region wurde ein kleines Loch gebohrt. Die In-vivo-Verabreichung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAVs) erfolgte durch stereotaktische Injektionen. Die relativ zum Bregma verwendeten NBM-Koordinaten betrugen posterior 0,35 mm, lateral 1,6 mm, in einer Tiefe von 4,55 mm von der Pia. Das Virus rAAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (University of North Carolina Vector Core, USA) (250 nl) wurde über 20 Minuten unverdünnt abgegeben, wohingegen rAAV5-Syn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry und rAAV5-Syn -DIO-mCherry (Addgene Inc., USA) Viruslösungen wurden 1:1 in PBS verdünnt und 400 nl über 20 Minuten injiziert. Die Tiere wurden mindestens drei Wochen lang gehalten, um vor Verhaltens- und elektrophysiologischen Experimenten eine optimale In-vivo-Virusexpression zu erreichen.

Für optogenetische Experimente wurde ein chronisches optisches Faserimplantat (200 µm Kerndurchmesser, numerische Apertur (NA) von 0,5) 100 µm über der Stelle der Virusinjektion im NBM oder bilateral im PL-Kortex unter Verwendung einer seitlichen Rotation von 15 eingeführt ° (1,94 mm anterior vom Bregma, 0,9 mm lateral, in einer Tiefe von 1,5 mm vom Pia) und mit Zahnzement und einer Schraube am Schädel befestigt. Die Vollnarkose wurde mit intraperitonealen Dosen von Naloxon (Inresa Arzneimittel, Freiburg, Deutschland; 0,4 mg/kg), Flumazenil (Fresenius, Bad Homburg, Deutschland; 0,5 mg/kg) und Atipamezol (Prodivet Pharmaceuticals, Belgien; 2,5 mg/kg) antagonisiert. .

Für elektrophysiologische Experimente wurden zwei Edelstahlschrauben auf den Schädel oberhalb des Kleinhirns und des rechten sensorischen Kortex implantiert, um als Erdungs- bzw. Referenzelektroden zu dienen. Anschließend wurde ein Schädelfenster über dem linken basalen Vorderhirn präpariert (AP = −0,35 mm, ML = 0,9 mm). Die Dura wurde entfernt und Versadrive-4 (Neuralynx), bestehend aus vier unabhängig antreibbaren Tetroden (Wolfram, 12 μm Durchmesser, California Fine Wire), wurde in einer anfänglichen Tiefe von 4,3 mm in das linke basale Vorderhirn implantiert. Das Schädelfenster wurde mit Knochenwachs bedeckt und der Versadrive-4-Aufbau mit Zahnzement am Schädel befestigt.

Für die chronische Verengungsverletzung (CCI26) wurden Mäuse unter Isofluran-Anästhesie (2 %) gesetzt und das Fell des rechten Oberschenkels rasiert. Es wurde ein Einschnitt an der seitlichen Hautoberfläche des Oberschenkels und durch den Musculus biceps femoris gemacht, um den Ischiasnerv direkt über seiner Verzweigung in den Nervus suralis, den Nervus peroneus communis und den Nervus tibialis freizulegen. Vier lose Ligaturen wurden mit chirurgischen Nähten aus dem Katzendarm um den Ischiasnerv gelegt, der Muskel und die Haut wurden anschließend zugenäht und die Tiere konnten sich 24 Stunden lang in einem beheizten Käfig erholen. Die Verhaltenstests begannen am zweiten Tag nach der Operation. Die gleiche Operation wurde ohne Platzierung der Ischiasnervligaturen bei Scheinkontrolltieren durchgeführt.

Die Mäuse wurden sicher in einem weichen Baumwolltuch festgehalten, um die optischen Patchkabel (0,5 NA-Doppelfasern, verbunden mit einem 1 × 2-Wellenlängenteilungs-Faseroptik-Drehgelenk, Doric Lenses Inc., Kanada) an den optischen Faserimplantaten zu befestigen. Das faseroptische Drehgelenk wiederum war über ein optisches Patchkabel (200 µm Kerndurchmesser, Thorlabs GmbH) an einen 473-nm-Laser (Shanghai Laser & Optics Century Co. Ltd, China) gekoppelt. Die Laserintensität wurde auf 4 mW eingestellt, gemessen an der Faserspitze mit einem Lichtmessgerät (PM100D, Thorlabs). Gepulstes Laserlicht (20 Hz, 10 ms Pulsdauer) wurde typischerweise für eine Dauer von 30 s angewendet, beginnend 15–20 s vor mechanischen oder thermischen Stimulationsereignissen, oder bei jedem Versuchseinleitungsereignis im 5-CSRT-Test, unter Verwendung von a Impulsgenerator (Kat.-Nr. 33220 A, Meilhaus Electronic GmbH, Deutschland).

Verhaltenstests wurden während des Lichtzyklus der Tiere durchgeführt. Die Tiere durchliefen zwei Akklimatisierungssitzungen in den Einrichtungskammern, in denen die mechanische oder thermische Empfindlichkeit getestet wurde. Die Ausgangsempfindlichkeit wurde über mehrere Tage hinweg in drei Testsitzungen beurteilt, bevor CCI-Operationen durchgeführt oder durch eine subkutane plantare Injektion von 25 μl komplettem Freundschen Adjuvans (CFA, Sigma-Aldrich) unter kurzer Isoflurananästhesie eine Entzündung der Pfote ausgelöst wurden. Verhaltenstests mit Tieren, die hM3D(Gq) exprimierten, und entsprechenden mCherry-Kontrollen wurden 1 Stunde nach der Injektion von Kochsalzlösung oder Clozapin-N-oxid (CNO, 2 mg/kg intraperitoneale Injektion; Biomol, Deutschland) durchgeführt. Die Experimentatoren waren stets blind für die Identität der Behandlungsgruppen.

Capsaicin (Sigma) wurde aus einer gefrorenen Dimethylsulfoxid-Stammlösung (DMSO, Thermo Fisher Scientific) (50X) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Thermo Fisher Scientific) verdünnt, um eine Capsaicin-Konzentration von 0,02 % (Gewicht/Vol) in 2 zu erhalten % DMSO. Die Tiere wurden kurzzeitig mit 2 % Isofluran (Baxter, Deutschland) anästhesiert und 20 µl der Capsaicinlösung wurden mit einer 30-G-Nadel subkutan in die Plantarfläche der Hinterpfote injiziert. Die Tiere wurden dann in einer transparenten Box (20 × 20 cm) auf einer Acrylglasplatte platziert und die Gesamtzeit, in der das Tier nozifensives Verhalten (Pfotenheben, Lecken, Zucken, Winden) zeigte, über einen Zeitraum von 5 Minuten von einem Experimentator bewertet blind für die Behandlungsbedingung.

Nach der Akklimatisierung an den von Frey-Aufbau (Ugo Basile Inc., Italien) wurde ein Satz Monofilamente, die sich bei Kräften von 0,04 g, 0,07 g, 0,16 g, 0,4 g, 0,6 g, 1,0 g und 1,4 g biegen, senkrecht darauf aufgebracht die Plantarfläche der Hinterpfote. Es wurden fünf Anwendungen pro Filament mit einem Mindestabstand von 1 Minute zwischen den einzelnen Anwendungen durchgeführt. Bei optogenetischen Stimulationsexperimenten wurde der Laser 20 s vor dem Anlegen des Filaments eingeschaltet und 10 s nach dem Anlegen des mechanischen Reizes ausgeschaltet. Insgesamt wurden während einer Testsitzung für jedes Tier fünf Anwendungen pro Filament und pro Laserzustand durchgeführt. Die Versuche wurden positiv bewertet, wenn das Tier entweder während der mechanischen Stimulation oder unmittelbar nach der Entfernung des Filaments ein nozifensives Reaktionsverhalten zeigte, einschließlich schnellem Pfotenrückzug, Lecken oder Schütteln der Pfote. Die Pfotenrückzugsschwelle wurde mit der Up-Down-Methode von Dixon60 bestimmt.

Der Hargreaves-Plantar-Testaufbau (Ugo Basile Inc., Italien) mit einer Infrarot-Wärmequelle (Modell 37370-001, Ugo Basile) wurde verwendet, um thermische Entzugsschwellen zu testen, indem Strahlungswärme auf die Plantaroberfläche der Hinterpfote angewendet wurde. Die Intensitätsstufe wurde auf 25 und die Abschaltzeit auf 30 s eingestellt. Ein Wärmereiz wurde nur während der Ruhephase angewendet und die Rückzugslatenz vom Beginn des Reizes an wurde aufgezeichnet. Pro Behandlungsbedingung und Tier wurden an einem Testtag sechs Versuche durchgeführt, wobei ein Mindestabstand zwischen den Versuchen von 2 Minuten eingehalten wurde. Während einer optogenetischen Hargreaves-Testsitzung wurden Laser-AN-Versuche nach dem Zufallsprinzip mit Laser-AUS-Versuchen durchsetzt. Der Laser wurde 20 s vor dem Einleiten des thermischen Reizes eingeschaltet und 5 s nach einer Pfotenrückzugsreaktion ausgeschaltet.

Der Freilandtest wurde in einer quadratischen Box (40 × 40 cm, 38 cm hoch) mit einer über der Box befestigten USB-Kamera durchgeführt, um die Bewegungsmuster der Tiere zu verfolgen und experimentelle Parameter mithilfe der ANY-maze-Software (Stoelting Co.) aufzuzeichnen. , Irland). Die Tiere waren nicht an diese Umgebung gewöhnt, so dass sie eine neue Arena zum Erkunden vorfanden. Zur Analyse wurde die Box in drei Zonen unterteilt. Als thigmotaktische Zone wurde ein 3 cm breiter Rand entlang der Kastenwände definiert. Als Mittelzone wurde eine quadratische Zone von 20 × 20 cm in der geometrischen Mitte der Box definiert. Der verbleibende Bereich wurde als Randzone definiert. Jede Maus wurde in die Mitte der Box gesetzt und durfte das gesamte Feld 8 Minuten lang frei erkunden. Der 8-Minuten-Test wurde in 30-Sekunden-Zeiträume unterteilt, wobei der Laser abwechselnd in einem zufälligen Takt ein- und ausgeschaltet wurde, sodass jede Maus insgesamt 4 Minuten lang beleuchtet wurde. Während des Tests wurden die Fortbewegungsparameter (Distanz und mittlere Geschwindigkeit) innerhalb jedes Segments aufgezeichnet. Zur Beurteilung des angstähnlichen Verhaltens wurde das Verhältnis der im Zentrum verbrachten Zeit zur Zeit in den thigmotaktischen Zonen herangezogen. Die motorische Funktion wurde anhand der gesamten zurückgelegten Strecke in allen drei Zonen beurteilt.

Drei Kohorten von ChAT-Cre-Mäusen, die entweder das hM3(Gq)-DRADD (n = 10) oder das ChR2(H134R)-Opsin (n = 8 und n = 10) in cholinergen NBM-Neuronen exprimieren, sowie sechs und neun Cre-ve-Kontrollen Tiere für die optogenetischen Testgruppen wurden in der 5-Choice Serial Reaction Time (5-CSRT)-Aufgabe unter Verwendung automatisierter Bussey-Saksida-Maus-Touchscreen-Operantenkammern (Campden Instruments, Loughborough, UK) und der ABET II TOUCH-Software (Lafayette Instrument, IN) trainiert , USA). Während der gesamten Trainings- und Testphase hatten die Tiere nur begrenzten Zugang zu Trinkwasser (30 Minuten pro Tag) und daher konnte Wasser als Belohnung verwendet werden, um das richtige Wahlverhalten in einzelnen Versuchen während der Aufgabe zu verstärken. Zur Gewöhnung und zum Training wurden die in Humby61 beschriebenen Verfahren und das ABET II TOUCH 5-CSRT-Aufgabenmodul (Version 3) befolgt. Kurz gesagt wurde in einem von fünf Fenstern für einen bestimmten Zeitraum ein Lichthinweis angezeigt, und ein Versuch wurde als korrekt gewertet, wenn das Tier den Monitor des Hinweisfensters innerhalb einer längeren Zeit von 5 Sekunden nach dem Verschwinden des Hinweises berührte. Wenn die Maus mit einem anderen Fenster interagierte (falscher Versuch) oder keine Touchscreen-Interaktion erkannt wurde (Auslassungsversuch), wurde nach der Präsentation des Hinweises eine bestrafende Zeitüberschreitung durch das Einschalten der Hausbeleuchtung für 5 Sekunden signalisiert. Eine Sitzung bestand aus 60 Versuchen und Mäuse führten eine Sitzung pro Tag durch. Die Cue-Dauer wurde sukzessive von 30 s auf 1,4 s reduziert, bis die Leistung in jeder Phase ein Kriterium von >80 % Genauigkeit [Anzahl richtiger Versuche/Gesamtzahl beantworteter Versuche (richtig + falsch)] und <20 % Auslassungen [Anzahl verpasster Versuche] erreichte Versuche/Anzahl der vorgelegten Versuche] an zwei aufeinanderfolgenden Tagen. DREADD-Tiere wurden über einen Zeitraum von 5 Tagen dreimal mit einer Cue-Dauer von 1,2 s getestet, nachdem sie eine Kochsalzlösung- oder CNO-Injektion erhalten hatten. Die Cue-Präsentationsdauer wurde in Wartungssitzungen zwischen den Testtagen um 0,2 s verlängert.

Optische Patchkabel wurden bereits in der späteren Trainingsphase der optogenetischen Kohorte täglich angeschlossen, ohne dass der Laser eingeschaltet werden musste. Bei Erreichen des Leistungskriteriums mit 1,8 s lang angezeigten Hinweisen wurden die Tiere mit einer Hinweispräsentationsdauer von 1,6 s getestet, wobei der Laser zu Beginn jedes Versuchs eingeschaltet und nach dem Sammeln der Wasserbelohnung oder unmittelbar nach der Verlängerung um 5 s ausgeschaltet wurde Zeitfenster, wenn keine korrekte Berührungsreaktion erkannt wurde. Nach Festlegung einer Basislinie durch Tests mit oder ohne eingeschaltetem Laser erhielt eine Kohorte von ChAT-Cre+- (n = 10) und Cre−-Mäusen (n = 9) eine subkutane plantare Injektion von 20 μl CFA (siehe Abschnitt über Verhaltenstests oben). ) und wurden dann an wechselnden Tagen mit ein- oder ausgeschaltetem Laser in halbzufälliger Reihenfolge getestet. Tiere, bei denen im Basiszeitraum mehr als 30 % Versuche ausgelassen wurden, wurden ausgeschlossen.

Am Ende des Experiments wurden die Mäuse mit einer Überdosis Kohlendioxid getötet und transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von 10 % Formalin (Merck, Deutschland), perfundiert. Die Gehirne wurden gesammelt und zusätzlich 24 Stunden lang bei 4 °C nachfixiert. Gehirnschnitte wurden mit einem Vibratom in einer Dicke von 50 µm geschnitten, mit Mowiol befestigt und mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, um die Position der Elektrodenstellen oder der AAV-Injektion bei Cre+-Tieren zu bestätigen.

Um Veränderungen der cholinergen Neuronenaktivität bei akuten und entzündlichen schmerzähnlichen Zuständen zu beurteilen, wurden die Tiere 90 Minuten nach einer Capsaicin-Injektion in die Hinterpfote und wiederholter mechanischer Stimulation (0,16 g Filament, 20-s-Intervall über einen Zeitraum von 10 Minuten) der entzündeten Pfote perfundiert am CFA-Tag 2 und am Tag 4 an der ipsilateralen Pfote von CCI- und Scheintieren. Um die durch die optogenetische Stimulation induzierte neuronale Aktivität zu beurteilen, wurde das gepulste Laserlicht fünfmal für 30 Sekunden während eines Zeitraums von 10 Minuten bei Cre+- und Cre--Tieren eingeschaltet, die dann 90 Minuten später perfundiert wurden. In ähnlicher Weise wurde DREADD-Tieren 2 Stunden vor der Perfusion CNO oder Kochsalzlösung injiziert.

Eine duale Immunmarkierung mit Anti-Fos (Kaninchen; ab190289, Abcam, UK) und Anti-ChAT (Ziege; AB144P, Merck) wurde im Verhältnis 1:1000 bzw. 1:250 verwendet. Kurz gesagt, die Schnitte wurden 10 Minuten lang in PBS/50 mM Glycin inkubiert, gefolgt von einem Blockierungsschritt von 60 Minuten in 4 % Pferdeserum mit 0,2 % Triton in PBS. Die Schnitte wurden mit beiden Primärantikörpern in der Blockierungslösung 24 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die Schnitte wurden anschließend in Blockierungslösung gewaschen (drei 10-minütige Waschgänge) und mit einer sekundären Antikörpermischung aus Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-488 und Esel-Anti-Ziege-Alexa-633 (Invitrogen, USA; jeweils 1:700) inkubiert Blockierungslösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-594 wurde für Gehirne mit AAV-induzierter EYFP-Expression verwendet. Um die EYFP-Fluoreszenz von AAV-transduzierten NBM-Terminals zu verstärken, wurde eine Untergruppe frontaler Hirnabschnitte mit einem Cocktail aus Kaninchen-Anti-Fos (1:1000) und Hühner-Anti-GFP (ab13970, Abcam; 1:1000, zuerst vorinkubiert) immunmarkiert 72 h bei 4 °C bei einer Verdünnung von 1:100 mit Gehirnschnitten von naiven C57bl6-Mäusen) Primärantikörpern (48 h Inkubation bei 4 °C), unter Verwendung von Esel-Anti-Kaninchen-Alexa-594 und Ziegen-Anti-Huhn-Alexa-488 (Invitrogen, USA; jeweils 1:700) Sekundärantikörper (wie oben, 2 h bei Raumtemperatur inkubiert). Die Gewebe wurden zweimal in PBS gewaschen, in Hoechst 33342 (1:10.000 verdünnt in PBS aus 10 mg/ml Stammlösung, Invitrogen) 10 Minuten lang inkubiert, erneut in PBS gewaschen und zuvor 10 Minuten lang in 10 mM TRIS-HCl weiter inkubiert Montage.

Darüber hinaus wurden zwei Sätze dreifacher immunhistochemischer Markierungsexperimente mit Kaninchen-Anti-Fos (Abcam, 1:1000), Ratten-Anti-Somatostatin (EMD Millipore, 1:300) und Meerschweinchen-Anti-Parvalbumin (Swant, 1:500) durchgeführt ) oder Kaninchen-Anti-Fos (Abcam, 1:1000), Ratten-Anti-Ctip2 (Abcam, 1:500) und Meerschweinchen-Anti-SATB2 (Synaptic Systems, 1:200). Die Schnitte wurden wie oben für das duale Immunfärbungsverfahren beschrieben verarbeitet und 48 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Als Sekundärantikörper wurden Esel-Anti-Kaninchen-IgG Alexa-488, Esel-Anti-Ratten-IgG Alexa-594 und Ziegen-Anti-Meerschweinchen-IgG Alexa 647 (alle Invitrogen, 1:700) verwendet. Die Spezifität der Antikörperfärbung wurde durch Weglassen der Primärantikörper getestet.

Die Schnitte wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Leica TCS SP8, Deutschland) mit einer Pixelauflösung von 1024 × 1024 abgebildet. Die Beleuchtungsparameter wurden für eine Bildserie über alle Tiere hinweg identisch gehalten. Zur Abbildung Fos-markierter Abschnitte wurde ein Trockenluftobjektiv (Leica, 10×/0,40, HC PL APO) und für die Abbildung dreifach markierter Abschnitte ein Immersionsobjektiv mit Korrekturring (Leica, 20×/0,75, HC PL APO) verwendet. Eine Montage konfokaler Bildstapel wurde über eine Tiefe von 25 µm aufgenommen, zentriert über dem interessierenden Bereich in der Mitte jedes Abschnitts, und die maximale Z-Projektion der Bilder wurde zum Zählen in der ImageJ-Software (Version 1.50b, National Institutes) angewendet of Health, USA). Der stereotaktische Atlas des Mausgehirns62 und der Referenzatlas des Allan Instituts (2011) wurden jeweils verwendet, um den interessierenden Bereich und die Umrisse der kortikalen Schicht gemäß den entsprechenden Referenzabschnitten zu definieren. Fos-markierte, doppelt und dreifach markierte Zellen in jedem interessierenden Bereich wurden manuell gezählt, wobei für alle Abschnitte innerhalb einer Versuchsgruppe die gleichen Kontrast- und Schwellenwerteinstellungen verwendet wurden. An der Grenze liegende positive Zellen wurden ausgeschlossen. Die Zellzahlen wurden umgerechnet, um die Anzahl der positiven Zellen im abgebildeten Stapelvolumen innerhalb des interessierenden Bereichs anzugeben (Zellen/mm3).

Eine interessierende Region (1,5 mm mediolateral × 1,0 mm dorsoventral groß) wurde als Zählrahmen über der NBM-Region mit der höchsten Expression von ChAT+- oder EYFP+-Neuronen verwendet. Als obere Begrenzung diente der untere Rand des Globus pallidus. Doppelt und dreifach markierte Fos+-Zellen innerhalb des Zählrahmens in beiden Hemisphären wurden manuell gezählt, wobei für alle Abschnitte innerhalb einer Versuchsgruppe die gleichen Kontrast- und Schwellenwerteinstellungen verwendet wurden. Die Anzahl der doppelt markierten Fos+-Neuronen der Capsaicin-Behandlungsgruppe sind Durchschnittswerte aus drei Gehirnabschnitten, ausgedrückt als % der ChAT+-Neuronen in jeder Hemisphäre. Da sich die Anzahl der doppelt und dreifach markierten Fos+-Neuronen zwischen den Hemisphären aller anderen Behandlungsgruppen nicht wesentlich unterschied, wurden die Daten aus den beiden Hemisphären für jeden Hirnschnitt gemittelt und konvertiert, um die Anzahl der positiven Zellen im abgebildeten Stapelvolumen anzuzeigen innerhalb des interessierenden Bereichs (Zellen/mm3).

Nach einer Woche Erholung von der Implantationsoperation wurden die Tetroden im Durchschnitt um 0,5 mm in die interessierende Region abgesenkt und blieben bis zum Ende des Experiments unverändert. Den Mäusen wurde zwei Tage Zeit gegeben, sich an das erhöhte Gitter des von Frey-Testaufzeichnungsaufbaus zu gewöhnen. Naive mechanische Empfindlichkeitstests wurden 4 Tage lang mit schwachen (0,07 g und 0,6 g) und starken (0,6 g und 1,0 g) Filamenten durchgeführt. Jedes Filament wurde zehnmal auf die Pflanzgefäßoberfläche der rechten Hinterpfote aufgetragen, wobei zwischen den Stimulationsversuchen ein Abstand von mindestens 60 Sekunden eingehalten wurde. Eine chronische Entzündung wurde durch subkutane Injektion von CFA-Lösung (25 μl, komplettes Freund-Adjuvans, Sigma) auf der Plantarseite der rechten Hinterpfote induziert. Mechanische Nozizeptionstests wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4, 7, 9, 12 und 14 nach der CFA-Injektion mit denselben Filamenten durchgeführt, die für die Basistests verwendet wurden. Am Ende der Verhaltensexperimente wurden die Mäuse mit 2 % Isofluran tief anästhesiert, die Position jeder Tetrodenspitze durch Anlegen von elektrischem Strom markiert, um eine kleine Läsion zu induzieren, und die Tiere wurden transkardial perfundiert, um das Gehirngewebe zu fixieren.

Neuronale Signale wurden über eine HS-18-MM-Kopfbühne mit dem Digital Lynx 4SX-System und der Geparden-Datenerfassungssoftware (Neuralynx) erfasst. Die Rohdaten wurden bei 32 kHz mit einem Bandpassfilter (1–6000 Hz) erfasst. Die Von-Frey-Stimulation wurde von einem speziell angefertigten Piezo-Wandler (Piezo-Keramikelement, Teilenummer 717770, Conrad) aufgezeichnet, der den Druck der Von-Frey-Stimulation in ein analoges Signal mit Bandpassfilterung bei 1–2000 Hz umwandelte31. Darüber hinaus wurden Videos mechanischer Stimulationsereignisse von einer USB-Kamera aufgezeichnet (20 Bilder/Sekunde), synchronisiert über ein über die Tastatur generiertes Ereignissignal mit dem Piezosignal. Der Beginn der Stimulation wurde als der Zeitpunkt des Kontakts des von Frey-Filaments mit der Hinterpfote definiert, der einer anfänglichen Auslenkung des Piezosignals entsprach, indem die Video- bzw. Piezoaufzeichnungen visuell untersucht wurden.

Das lokale Feldpotenzial (LFP) und die Aktivität einzelner Einheiten wurden mit benutzerdefinierten Skripten unter Verwendung von MATLAB63 (The Mathworks Inc, Version R2014a) analysiert. Statistische Analysen und Post-hoc-Tests wurden in Graphpad Prism (Version 9) durchgeführt.

Für die Spektrogrammanalyse der LFP-Aktivität wurden 3 s vor und 3 s nach Beginn der von Frey-Filamentanwendung für Entzugsversuche aus den Rohdaten extrahiert. Pro Tier wurde ein Kanal einer Tetrode analysiert. Rohdatenepisoden wurden mit einem Tschebyscheff-Tiefpassfilter Typ I 3. Ordnung mit 0,5-dB-Welligkeiten im Durchlassband und einer Durchlassbandkantenfrequenz von 200 Hz gefiltert und auf 1000 Hz heruntergesampelt. Leistungsspektrogramme wurden mit der Morlet-Wavelets-Funktion erstellt, wobei die Zentralfrequenz auf 0,8125 Hz, die Frequenzgenauigkeit auf 0,5 Hz und die Zeitauflösung auf 1 ms eingestellt wurden. Die Basisperiode von 1 Sekunde vor Beginn der Stimulation wurde verwendet, um jedes 0,5-Hz-Frequenzsegment mit dem jeweiligen Mittelwert zu normalisieren und als prozentuale Abweichung von der Basislinie vor der Stimulation auszudrücken. Die normalisierten Leistungsspektrogramme einzelner Versuche wurden dann für schwache und starke Filamente für jede Maus und jeden Tag gemittelt. Die großen Mittelwerte dieser normalisierten Spektrogramme für alle Tiere sind in den Abbildungen dargestellt. 1e, 2c und ergänzende Abb. 3a.

Für die quantitative Analyse werden Mittelwerte von vier Frequenzbändern, einschließlich Theta (4–8 Hz), Alpha (8–14 Hz), Beta (14–30 Hz) und Gamma (30–100 Hz), in den Leistungsspektrogrammen von verwendet Jedes Tier wurde über den gesamten Zeitraum von 2 Sekunden nach der Stimulation berechnet. Für die Zeitverlaufsanalyse wurden normalisierte Spektrogramme jedes Tieres in 100-ms-Bins eingeteilt und Durchschnittswerte für jedes Frequenzband berechnet. Als Referenz wurde die mittlere Wartezeit der entsprechenden Versuche für ein Spektrogramm berechnet. Um die individuelle Filamentkraft mit der Zunahme der Spektrogrammleistung zu korrelieren, wurde die normalisierte Leistung über die 2 Sekunden nach der Stimulation für jedes Filament und Frequenzband für jedes Tier gemittelt.

Die Spike-Sortierung wurde mit Kilosort264 durchgeführt, um einzelne Einheiten zu isolieren. Die Rohdaten wurden mit einem Bandpassfilter von 300 bis 6000 Hz vorverarbeitet. Driftkorrektur, Unit-Clustering und Template-Matching wurden automatisch basierend auf der Template-Matching-Methode durchgeführt. Automatisch geclusterte Einheiten wurden manuell in Phy (Version 2.0; https://github.com/cortex-lab/phy) kuratiert, wobei Wellenformähnlichkeit und Clustermerkmale, Feuerrate sowie Kreuzkorrelations- und Autokorrelationsmerkmale verwendet wurden.

Für die Analyse der hervorgerufenen Aktivitätsänderungen in den Einzeleinheitsdaten wurde die Zündaktivität jedes Entzugsversuchs an den Stimulationsbeginn für die Entzugsversuche entweder aller Filamente oder getrennt für schwache und starke Filamentgruppen angepasst. Die Feuerrate über die Versuche hinweg wurde für 250-ms-Bins berechnet und die Z-Scores wurden auf der Grundlage des Mittelwerts und der Standardabweichung der 3-sekündigen Basisaktivitäten vor der Stimulation berechnet44. Einheiten mit signifikant erhöhter oder verringerter Aktivität wurden identifiziert, wenn mindestens einer der normalisierten Bereiche im Zeitraum von 3 s nach der Stimulation 3,09 bzw. –3,09 überschritt, was einem Signifikanzniveau von P < 0,001 entspricht. Andernfalls wurde die Einheit als nicht reagierende Einheit eingestuft. Einheiten wurden von dieser Analyse ausgeschlossen, wenn die mittlere Feuerrate weniger als 1 Hz oder die Anzahl der Entzugsversuche weniger als 3 betrug. Um die Stärke der durch Stimulation hervorgerufenen Reaktionen zu vergleichen, wurde der maximale und minimale Z-Score für alle Einheiten extrahiert mit deutlich erhöhten bzw. verringerten Feuerraten innerhalb der 3 Sekunden nach der Stimulation.

Für die Einzeleinheitsklassifizierung wurden verschiedene Parameter berechnet, darunter: Feuerungsrate, Variationskoeffizient der Intervalle zwischen den Spitzen, Spitze-Spitze-Amplitude der Wellenform, Zeit zwischen frühen und späten Wellenformspitzen, Zeit vom Wellenformtiefpunkt bis zum Rückkehrpunkt Basislinie und Wellenformasymmetrie (der Quotient aus der Differenz zwischen der Zeit von der Basislinie bis zum frühen Peak und vom späten Peak bis zur Rückkehr der Basislinie zur Summe dieser beiden Zeiten). Diese mehrdimensionalen Parameter wurden mithilfe der Matlab-Funktion t-SNE (t-verteilte stochastische Nachbareinbettung)65 in zwei Dimensionen projiziert. Dann wurde der K-Means-Algorithmus angewendet, um diese Einheiten in zwei Cluster zu gruppieren. Basierend auf der Clustertrennung wurde die beste Einheitenklassifizierung mit nur zwei Wellenformparametern erreicht: dem Asymmetrieparameter und der Zeit vom Tiefpunkt bis zur Rückkehr zur Grundlinie. Wir haben nicht versucht zu unterscheiden, ob es sich bei den von uns klassifizierten Einheiten um erregende oder hemmende Neuronen handelte, und wir können auch nicht zwischen Projektionsneuronen und Interneuronen unterscheiden.

Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Wenn nicht anders angegeben. Prism (Version 9) wurde für die statistische Analyse aller Verhaltensdaten und für die Durchführung von Post-hoc-Vergleichstests elektrophysiologischer Datensätze verwendet. Ein t-Test mit einer Stichprobe wurde durchgeführt, um festzustellen, ob bestimmte Frequenzbänder des LFP-Leistungsspektrogramms von Entzugsversuchen signifikant von der Basislinie vor der Stimulation abwichen. Zur Prüfung auf Ausreißer wurde die ROUT-Methode mit Q = 0,5 % verwendet. Für die Zeitverlaufsanalyse in Abb. 1g und der ergänzenden Abb. 1b wurde eine einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und dem Mehrfachvergleichstest von Dunnett für Unterschiede zur Grundlinie vor der Stimulation verwendet. Alle gruppierten Datensätze wurden mit einer zweifaktoriellen ANOVA unter Verwendung des Sidak-Tests für mehrere Vergleiche relevanter Behandlungskombinationen analysiert, die signifikante Hauptgruppeneffekte hatten. Der ungepaarte Student-t-Test wurde verwendet, um die Behandlungseffekte im Vergleich zu einer Kontrollgruppe zu testen. Der Chi-Quadrat-Kontingenztest für die Einheitsantworttypen (ergänzende Abbildung 2b) wurde für alle Zeiträume sowie für paarweise Zeitraumkombinationen angewendet, um den abweichenden Datensatz zu erkennen. In allen Tests wurde ein P-Wert von <0,05 als signifikant angesehen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten elektrophysiologischen Daten wurden im heiDATA-Repository unter dem Zugangscode [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X] abgelegt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Matlab-Skripte zur Analyse elektrophysiologischer Daten sind zusammen mit den Rohdaten im selben Repository verfügbar [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X].

Tan, LL & Kuner, R. Neokortikale Schaltkreise bei Schmerzen und Schmerzlinderung. Nat. Rev. Neurosci. 22, 458–471 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kuner, R. & Kuner, T. Zelluläre Schaltkreise im Gehirn und ihre Modulation bei akuten und chronischen Schmerzen. Physiol. Rev. 101, 213–258 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Naser, PV & Kuner, R. Molekulare, zelluläre und Kreislaufgrundlagen der cholinergen Schmerzmodulation. Neurowissenschaften 387, 135–148 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mesulam, MM, Mufson, EJ, Wainer, BH & Levey, AI Zentrale cholinerge Wege bei der Ratte: ein Überblick basierend auf einer alternativen Nomenklatur (Ch1-Ch6). Neuroscience 10, 1185–1201 (1983).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Okada, K. et al. Verschiedene cholinerge Zellgruppen im basalen Vorderhirn regulieren die soziale Interaktion und das soziale Erinnerungsgedächtnis. Wissenschaft. Rep. 11, 13589 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaves-Coira, I., Rodrigo-Angulo, ML & Nunez, A. Bilaterale Bahnen vom basalen Vorderhirn zu sensorischen Kortizes können zur synchronen sensorischen Verarbeitung beitragen. Vorderseite. Neuroanat. 12, 5 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Fang, Y.-Y., Yamaguchi, T., Song, SC, Tritsch, NX & Lin, D. Ein hypothalamischer Mittelhirnweg, der für die Steuerung des mütterlichen Verhaltens unerlässlich ist. Neuron 98, 192–207.e110 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, LL, Oswald, MJ & Kuner, R. Neurobiologie von Gehirnschwingungen bei akuten und chronischen Schmerzen. Trends Neurosci. 44, 629–642 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ploner, M., Sorg, C. & Gross, J. Gehirnrhythmen des Schmerzes. Trends Cogn. Wissenschaft. 21, 100–110 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yue, L., Iannetti, GD & Hu, L. Der neuronale Ursprung nozizeptiv induzierter Gammaband-Oszillationen. J. Neurosci. 40, 3478–3490 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melzer, S. & Monyer, H. Diversität und Funktion kortikopetaler und kortikofugaler GABAerger Projektionsneuronen. Nat. Rev. Neurosci. 21, 499–515 (2020).

Bartho, P. et al. Charakterisierung neokortikaler Hauptzellen und Interneurone durch Netzwerkinteraktionen und extrazelluläre Merkmale. J. Neurophysiol. 92, 600–608 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Yague, JG, Tsunematsu, T. & Sakata, S. Deutliche zeitliche Koordination der spontanen Populationsaktivität zwischen basalem Vorderhirn und auditorischem Kortex. Vorderseite. Neuronale Schaltkreise 11, 64 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Saunders, A., Granger, AJ & Sabatini, BL Gemeinsame Freisetzung von Acetylcholin und GABA aus cholinergen Neuronen des Vorderhirns. eLife 4, e06412 (2015).

Apkarian, AV et al. Chronische Rückenschmerzen sind mit einer verminderten Dichte der präfrontalen und thalamischen grauen Substanz verbunden. J. Neurosci. 24, 10410–10415 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji, G. et al. Kognitive Beeinträchtigung bei Schmerzen durch Amygdala-bedingte präfrontale kortikale Deaktivierung. J. Neurosci. 30, 5451–5464 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Z. et al. Rolle prälimbischer GABAerger Schaltkreise bei sensorischen und emotionalen Aspekten neuropathischer Schmerzen. Cell Rep. 12, 752–759 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cheriyan, J. & Sheets, PL Veränderte Erregbarkeit und lokale Konnektivität von mPFC-PAG-Neuronen in einem Mausmodell für neuropathische Schmerzen. J. Neurosci. 38, 4829–4839 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jefferson, T., Kelly, CJ & Martina, M. Differenzielle Neuordnung erregender Eingaben in den medialen präfrontalen Kortex in Modellen für chronische Schmerzen. Vorderseite. Neural Circuits 15, 791043 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaborszky, L. et al. Spezifische basale cholinerge Schaltkreise zwischen Vorderhirn und Hirnrinde koordinieren kognitive Vorgänge. J. Neurosci. 38, 9446–9458 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tritsch, NX, Granger, AJ & Sabatini, BL Mechanismen und Funktionen der GABA-Kofreisetzung. Nat. Rev. Neurosci. 17, 139–145 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alcamo, EA et al. Satb2 reguliert die Identität der callosalen Projektionsneuronen in der sich entwickelnden Großhirnrinde. Neuron 57, 364–377 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Molyneaux, BJ, Arlotta, P., Menezes, JRL & Macklis, JD Spezifikation neuronaler Subtypen in der Großhirnrinde. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427–437 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Huang, J. et al. Ein neuronaler Schaltkreis zur Aktivierung der absteigenden Modulation neuropathischer Schmerzen. Nat. Neurosci. 22, 1659–1668 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roth Bryan, L. DREADDs für Neurowissenschaftler. Neuron 89, 683–694 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bennett, GJ & Xie, YK Eine periphere Mononeuropathie bei Ratten, die zu Störungen des Schmerzempfindens führt, wie sie beim Menschen auftreten. Schmerz 33, 87–107 (1988).

Bourgeais, L., Gauriau, C. & Bernard, JF Projektionen vom nozizeptiven Bereich des zentralen Kerns der Amygdala zum Vorderhirn: eine PHA-L-Studie an der Ratte. EUR. J. Neurosci. 14, 229–255 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Detari, L., Semba, K. & Rasmusson, DD Reaktionen kortikaler EEG-bezogener basaler Vorderhirnneuronen auf Hirnstamm- und sensorische Stimulation bei mit Urethan betäubten Ratten. EUR. J. Neurosci. 9, 1153–1161 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, YQ, Mei, J., Lu, SG & Zhao, ZQ Altersbedingte Veränderungen der Reaktionen von Neuronen des Nucleus basalis magnozelluläris auf periphere nozizeptive Reize. Gehirnres. 948, 47–55 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gross, J., Schnitzler, A., Timmermann, L. & Ploner, M. Gamma-Oszillationen im primären somatosensorischen Kortex des Menschen spiegeln die Schmerzwahrnehmung wider. PLoS Biol. 5, e133 (2007).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Tan, LL et al. Gamma-Oszillationen im somatosensorischen Kortex rekrutieren präfrontale und absteigende serotonerge Bahnen bei Aversion und Nozizeption. Nat. Komm. 10, 983–999 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Schulz, E. et al. Präfrontale Gamma-Oszillationen kodieren tonischen Schmerz beim Menschen. Großhirn. Cortex 25, 4407–4414 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ploner, M. & Gross, J. Gammaschwingungen prägen den Schmerz bei Tieren und Menschen. Trends Cogn. Wissenschaft. 23, 1086 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Paquette, T., Tokunaga, R., Touj, S., Leblond, H. & Piche, M. Regulierung kortikaler Blutflussreaktionen durch den Nucleus basalis von Meynert während der nozizeptiven Verarbeitung. Neurosci. Res. 149, 22–28 (2019).

Artikel PubMed Google Scholar

Pafundo, DE, Miyamae, T., Lewis, DA & Gonzalez-Burgos, G. Cholinerge Modulation der neuronalen Erregbarkeit und wiederkehrende Erregungshemmung in präfrontalen Kortexschaltkreisen: Auswirkungen auf Gammaoszillationen. J. Physiol. 591, 4725–4748 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Howe, WM et al. Die Freisetzung von Acetylcholin im präfrontalen Kortex fördert Gamma-Oszillationen und Theta-Gamma-Kopplung während der Erkennung von Hinweisen. J. Neurosci. 37, 3215–3230 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schweinhardt, P. & Bushnell, MC Schmerzbildgebung bei Gesundheit und Krankheit – wie weit sind wir gekommen? J. Clin. Investig. 120, 3788–3797 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tracey, I. Neuroimaging-Mechanismen bei Schmerzen: von der Entdeckung bis zur Übersetzung. Pain 158(Suppl 1), S115–S122 (2017).

Artikel MathSciNet PubMed Google Scholar

Kim, JA & Davis, KD Neuronale Oszillationen: Verständnis eines neuronalen Schmerzcodes. Neurowissenschaftler 27, 544–570 (2020).

Vierck, CJ, Yezierski, RP & Wiley, RG Schmerzempfindlichkeit nach Verlust cholinerger basaler Vorderhirnneuronen (CBF) bei der Ratte. Neurowissenschaften 319, 23–34 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, YY et al. Neuronale Bahnen bei der cholinergen Modulation chronischer Schmerzen im medialen Septum: deutlicher Beitrag des anterioren cingulären Kortex und des ventralen Hippocampus. Schmerz 159, 1550–1561 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Dale, J. et al. Eine Erhöhung der kortikalen Kontrolle hemmt Schmerzen. Cell Rep. 23, 1301–1313 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Talay, RS et al. Die pharmakologische Wiederherstellung antinozizeptiver Funktionen im präfrontalen Kortex lindert chronische Schmerzen. Prog. Neurobiol. 201, 102001 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gan, Z. et al. Wiederholte nicht-invasive präfrontale Stimulation kehrt neuropathische Schmerzen durch neuronale Umgestaltung bei Mäusen um. Prog. Neurobiol. 201, 102009 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Radzicki, D., Pollema-Mays, SL, Sanz-Clemente, A. & Martina, M. Der Verlust der M1-Rezeptor-abhängigen cholinergen Erregung trägt zur mPFC-Deaktivierung bei neuropathischen Schmerzen bei. J. Neurosci. 37, 2292–2304 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koga, K. et al. Die Stimulierung muskarinischer M1-Rezeptoren im anterioren cingulären Kortex reduziert die mechanische Überempfindlichkeit durch GABAerge Übertragung bei Ratten mit Nervenverletzungen. Gehirnres. 1704, 187–195 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dunckley, P. et al. Aufmerksamkeitsmodulation viszeraler und somatischer Schmerzen. Neurogastroenterol. Beweglich. 19, 569–577 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ploner, M., Lee, MC, Wiech, K., Bingel, U. & Tracey, I. Die funktionelle Konnektivität des Prästimulus bestimmt die Schmerzwahrnehmung beim Menschen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 107, 355–360 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Baliki, MN & Apkarian, AV Nozizeption, Schmerz, negative Stimmungen und Verhaltensauswahl. Neuron 87, 474–491 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eldufani, J. & Blaise, G. Die Rolle von Acetylcholinesterase-Inhibitoren wie Neostigmin und Rivastigmin bei chronischen Schmerzen und kognitiven Funktionen im Alter: ein Überblick über aktuelle klinische Anwendungen. Alzheimer-Demenz. 5, 175–183 (2019).

Artikel Google Scholar

Laalou, FZ et al. Beteiligung des basalen cholinergen Vorderhirns an der Vermittlung einer Vollnarkose (Propofol). Anaesthesiology 108, 888–896 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mathias, JL, Cant, ML & Burke, ALJ Schlafstörungen und Schlafstörungen bei Erwachsenen mit chronischen Schmerzen: eine Metaanalyse. Schlafen. Med. 52, 198–210 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Choy, EH Die Rolle des Schlafes bei Schmerzen und Fibromyalgie. Nat. Rev. Rheumatol. 11, 513–520 (2015).

Artikel PubMed Google Scholar

Qi, J. et al. Eine veränderte funktionelle Konnektivität zwischen dem Nucleus basalis von Meynert und dem anterioren cingulären Kortex ist mit einer verminderten Aufmerksamkeitsleistung nach völligem Schlafentzug verbunden. Verhaltensgehirn Res. 409, 113321 (2021).

Artikel Google Scholar

Liu, AKL, Chang, RC-C., Pearce, RKB & Gentleman, SM Nucleus basalis von Meynert erneut aufgegriffen: Anatomie, Geschichte und unterschiedliche Beteiligung bei Alzheimer und Parkinson. Acta Neuropathologica 129, 527–540 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lv, Q. et al. Tiefe Hirnstimulation: eine potenzielle Behandlung für Demenz bei Alzheimer-Krankheit (AD) und Parkinson-Demenz (PDD). Vorderseite. Neurosci. 12, 360 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Gratwicke, J. et al. Ruhezustandsaktivität und Konnektivität des Nucleus basalis von Meynert und des Globus pallidus bei Lewy-Körper-Demenz und Parkinson-Demenz. Neuroimage 221, 117184 (2020).

Artikel PubMed Google Scholar

Oswal, A. et al. Kortikale Konnektivität des Nucleus basalis von Meynert bei Parkinson-Krankheit und Lewy-Körper-Demenz. Gehirn: J. Neurol. 144, 781–788 (2021).

Artikel Google Scholar

Lowell, BB, Olson, D. & Yu, J. Entwicklung und Phänotyp von ChAT-IRES-Cre-Mäusen. MGI J:114556 (2006).

Dixon, WJ Effiziente Analyse experimenteller Beobachtungen. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20, 441–462 (1980).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Humby, T., Laird, FM, Davies, W. & Wilkinson, LS Visuell-räumliche Aufmerksamkeitsfunktion bei Mäusen: Wechselwirkungen zwischen cholinergen Manipulationen und Genotyp. EUR. J. Neurosci. 11, 2813–2823 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paxinos, G. & Franklin, KBJ The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 2. Aufl. (Academic Press, 2001).

Oswald, MJ, Han, Y. & Kuner, R. Eine neuartige Rolle für den cholinergen basalen Vorderhirnkern von Meynert bei chronischen Schmerzen durch Modulation des prälimbischen Kortex [Elektrophysiologie-Datensatz]. heiDATA https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X (2022).

Pachitariu, M., Steinmetz, NA, Kadir, SN, Carandini, M. & Harris, KD Schnelle und genaue Spike-Sortierung von Sonden mit hoher Kanalanzahl mit KiloSort. Adv. Neuronale Inf. Verfahren. Syst. 29, 4448–4456 (2016).

Google Scholar

Van der Maaten, L. & Hinton, G. Visualisieren von Daten mit t-SNE. J. Machine Learning Res. 9, 2579–2605 (2008).

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken C. Gartner für die Sekretariatsunterstützung und N. Gehrig, V. Buchert, D. Baumgartl-Ahlert und B. Zimmermann für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft an RK in Form von Zuschüssen im CRC1158-Konsortium für chronische Schmerzen (Projekt B01, B06) unterstützt. MO erhielt einen Startzuschuss aus CRC1158-Mitteln. Die Autoren bedanken sich für die Stipendienunterstützung für ZG vom Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, für HL vom China Scholarship Council und PVN von der Studienstiftung des Deutschen Volkes sowie für eine Karriere als junger Wissenschaftler Stipendium aus CRC1158-Mitteln. Die Autoren danken der Interdisciplinary Neurobehavioral Core Facility der Medizinischen Fakultät Heidelberg für die Unterstützung bei Verhaltensexperimenten und dem vom Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst Baden-Württemberg (MWK) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft unterstützten Datenspeicherdienst (SDS@hd). (DFG) durch Förderung INST 35/1314-1 FUGG und INST 35/1503-1 FUGG.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Pharmakologisches Institut, Medizinische Fakultät Heidelberg, Universität Heidelberg, Im Neuenheimer Feld 366, 69120, Heidelberg, Deutschland

Manfred J. Oswald, Yechao Han, Han Li, Samuel Marashli, Deniz Nouri Oglo, Bhavya Ojha, Paul V. Naser, Zheng Gan und Rohini Kuner

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

MO, YH, ZG, HL, DU, BO, SM und PVN führten alle Nassexperimente unter Aufsicht von RKMO durch und unterstützten bei der Planung und Ausführung elektrophysiologischer Protokolle. RK konzipierte das Projekt und alle Autoren lieferten regelmäßig konzeptionelle Beiträge. MO, HL und ZG haben die Zahlen erstellt. RK hat das Manuskript verfasst und alle Autoren haben beim Verfassen des Manuskripts und bei der Präsentation der Daten Kommentare und methodische Informationen bereitgestellt.

Korrespondenz mit Rohini Kuner.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Patrick Sheets und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Oswald, MJ, Han, Y., Li, H. et al. Der cholinerge basale Vorderhirnkern von Meynert reguliert chronisches schmerzähnliches Verhalten durch Modulation des prälimbischen Kortex. Nat Commun 13, 5014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

Zitat herunterladen

Eingegangen: 29. Januar 2022

Angenommen: 03. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein gemeinsam nutzbarer Link verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.