Gründung eines GPI

May 18, 2023

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 11856 (2015) Diesen Artikel zitieren

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HIV-Impfstoffe sollten Immunreaktionen sowohl an den Schleimhauteintrittspforten auslösen, um die Übertragung zu blockieren, als auch an systemischen Kompartimenten, um disseminierte Viren zu beseitigen. Es hat sich gezeigt, dass die gleichzeitige Verabreichung von Schleimhautadjuvantien für die Induktion einer wirksamen Schleimhautimmunität durch nicht replizierende Impfstoffe von wesentlicher Bedeutung ist. Zuvor wurde festgestellt, dass ein neuartiges Zytokin, GIFT4, das durch Fusion von GM-CSF und Interleukin-4 hergestellt wurde, die Proliferation von B-Zellen und die Effektorfunktion simuliert. Hierin wurde eine membranverankerte Form von GIFT4 durch Fusion einer Glykolipid (GPI)-verankernden Sequenz konstruiert und als molekulares Adjuvans in Env-angereicherte HIV-Virus-ähnliche Partikel (VLPs) eingebaut. Meerschweinchen wurden mit den resultierenden HIV-VLPs über einen intramuskulären Priming-intranasalen Boosting-Immunisierungsweg immunisiert. Die GIFT4-haltigen VLPs induzierten höhere Niveaus systemischer Antikörperreaktionen mit deutlich erhöhter Bindungsavidität und verbesserter Neutralisierungsbreite und -stärke bei einer Reihe ausgewählter Stämme sowie höhere IgG- und IgA-Niveaus an mehreren Schleimhautstellen. Somit haben die neuartigen GPI-GIFT4-haltigen VLPs das Potenzial, zu einem prophylaktischen HIV-Impfstoff entwickelt zu werden. Der Einbau von GPI-verankertem GIFT4 in VLPs als molekulares Adjuvans stellt einen neuen Ansatz zur Erhöhung ihrer Immunogenität dar.

Nach drei Jahrzehnten der Bemühungen, die Pathogenese und die Folgen einer Infektion mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) zu verstehen, stehen wir immer noch vor der beängstigenden Tatsache, dass 34 Millionen Menschen mit HIV-1 leben und jedes Jahr etwa 2 Millionen Neuinfektionen und 1,6 Millionen Todesfälle auftreten1 ,2,3. Die antiretrovirale Kombinationstherapie (ART) hat außerordentliche Erfolge bei der Reduzierung der HIV-Übertragung und der Verlängerung des Lebens gezeigt. Allerdings stellt die ART-Behandlung die Immungesundheit nicht vollständig wieder her und eine Reihe von entzündungsbedingten und/oder immunschwächebedingten Komplikationen können lebenslang bestehen bleiben4. Die überwiegende Mehrheit der infizierten Menschen in Entwicklungsländern hat keinen Zugang zu antiviralen Medikamenten. Ein prophylaktischer Impfstoff bleibt die oberste Priorität zur Lösung der HIV-bezogenen Herausforderungen und Probleme.

Die jüngsten Bemühungen zur Entwicklung eines HIV-Impfstoffs konzentrierten sich auf die Auslösung weitgehend neutralisierender Antikörper- und T-Zell-Reaktionen. Fortschritte bei HIV- und SIV-Pathogenesestudien haben jedoch gezeigt, dass das Frühstadium der Infektion an der Schleimhauteintrittspforte einen Engpass für Virusinfektionen darstellt und in diesem Stadium potenzielle Virusanfälligkeiten identifiziert wurden5,6. Wenn sich Gründerpopulationen infizierter Zellen nicht ausreichend ausdehnen, um eine sich selbst ausbreitende Infektion auszulösen, besteht die Gefahr der Eliminierung des Virus7. In Anbetracht der kleinen Gründerpopulationen, die in Studien zur SIV-Schleimhautübertragung aufgedeckt und auf die HIV-Übertragung geschlossen wurden, bietet dieses Stadium die maximale Chance für eine durch Impfstoffe vermittelte Krankheitsprävention. Die meisten HIV-Infektionen werden durch sexuelle Übertragung erworben8. Da HIV Immunzellen direkt als Wirte nutzt und provirale DNA in die Genomen der Zielzellen integriert, können Schleimhautimpfstoffe eine disseminierte Infektion eher vollständig verhindern als Impfstoffe, die die Viruslast begrenzen sollen8.

Eine Reihe von Studien deuten auf eine vielversprechende Rolle von Zytokinen als wirksame Adjuvantien zur Verstärkung der Immunantwort hin9,10,11,12. Bei Rhesusaffen sorgte ein heterologes Prime-Boost-Impfschema mit Koexpression von GM-CSF und Impfantigenen für einen besseren Schutz gegen SIV-Infektionen im Vergleich zu einer Gruppe ohne Adjuvans. Dies korrelierte gut mit der erhöhten Avidität der ausgelösten Env-spezifischen IgG-Antikörper in der mit Adjuvans behandelten Gruppe13,14. Es wurde vermutet, dass GM-CSF die Antikörper-Avidität steigern könnte, indem es Antigen-präsentierende Zellen rekrutiert und deren Reifung stimuliert, insbesondere dendritische Zellen der myeloischen Linie13,14. Es wurde gezeigt, dass GM-CSF und IL-4 zusammen die Differenzierung von Monozyten in dendritische Zellen induzieren15,16,17. Es wurde gezeigt, dass IL-4 eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Differenzierung von Vorläufer-T-Helferzellen in die Th2-Linie spielt und daher humorale Immunantworten erleichtert18.

Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass gentechnisch veränderte Env-Proteine ​​mit deutlich verbesserter Effizienz in virusähnliche Partikel (VLPs) eingebaut werden können19. Das eingebaute Env-Protein behält seine konservierten Epitope und wahrscheinlich die native Konformation, wenn es in die VLPs eingebaut wird19. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde membranverankertes Flagellin konstruiert und als Adjuvans in VLPs eingebaut. Die daraus resultierenden chimären HIV-VLPs (cVLPs) lösten verstärkte neutralisierende Antikörper- und Schleimhautreaktionen aus, was ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung eines in Env-angereicherten VLPs miteingebauten Adjuvans für die Auslösung sowohl systemischer als auch mukosaler Immunreaktionen ist3. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir herausgefunden, dass ein Fusokin (Fusionsprotein aus zwei Zytokinen) aus GM-CSF und IL4 (bezeichnet als GIFT4) zu einer neuartigen B-Zell-Effektorfunktion führt, die sich in einem veränderten pro-immunen Zytokin-Sekretionsprofil und einem robusten B-Zell-Effektor manifestiert -Zellmitogene Reaktion20. In der vorliegenden Studie haben wir eine membrangebundene Form von GIFT4 erzeugt, indem wir die Signalsequenz des CD59-Glykolipids (Glycosylphosphatidylinositol, GPI) mit der C-terminalen Sequenz von GIFT4 im Leserahmen fusionierten und das membranverankerte GIFT4 in Env-angereicherte VLPs eingebaut haben. Wir fanden heraus, dass diese cVLPs, die sowohl eine hohe Env-Dichte als auch membranverankertes GIFT4 enthalten, stark verstärkte Env-spezifische Antikörperreaktionen mit verbesserter Qualität hervorriefen, was sich in einer erhöhten Avidität und Neutralisierungsaktivität widerspiegelt. Diese Daten zeigen, dass die cVLPs das Potenzial haben, zu einem HIV-Schleimhautimpfstoff weiterentwickelt zu werden.

Ein Diagramm der membrangebundenen Form des GIFT4-Gens ist in Abb. 1a dargestellt. Das Melittin-Signalpeptid (SP) und die CD59-GPI-Verankerungssignal-kodierenden Sequenzen wurden mit den 5'- und 3'-Enden der GIFT4-kodierenden Sequenz im Leserahmen fusioniert, um die Membraninsertion von GPI-GIFT421 zu erleichtern. Western Blot (Abb. 1b) unter Verwendung von Anti-GM-CSF-Antikörpern detektierte eine Bande, die bei 37 kDa im Lysat von sf9-Zellen wanderte, die mit rekombinanten Baculoviren (rBVs) infiziert waren, die das GPI-GIFT4-Gen exprimierten (Spur 1 in Abb. 1b). auf die erwartete Größe von GPI-verankertem GIFT4. Die Membranverankerung des exprimierten GPI-GIFT4 wurde weiter durch die erhöhte Fluoreszenzintensität gezeigt, die durch FACS-Analyse der rBV-infizierten Zellen nach Anfärbung der Zelloberfläche mit Anti-GM-CSF-Antikörpern, gefolgt von PE-konjugierten Sekundärantikörpern, gemessen wurde (Abb. 1c). ).

Diagramm der GPI-verankerten Form von GIFT4 und der Expression von Insektenzellen.

a, eine schematische Darstellung des für GPI-GIFT4 kodierenden Gens. Kodierungssequenzen für den Melittin-SP- und murinen CD59-GPI-Anker wurden an den 5'- bzw. 3'-Enden der für GIFT4 kodierenden DNA fusioniert, um das Gen voller Länge zu bilden. b, zelluläre GPI-GIFT4-Expression. Western Blots wurden mit Anti-GM-CSF-Antikörpern entwickelt. Spur 1: Gesamtzelllysat einer GPI-GIFT4-exprimierenden rBV-infizierten Insektenzellprobe; Spur 2, gereinigtes GM-CSF-Protein; Spur 3: Gesamtzelllysat von HIV-Env-exprimierenden rBV-infizierten Zellen als Kontrolle. c, FACS-Analyse der GPI-GIFT4-Zelloberflächenexpression in rBV-infizierten Insektenzellproben. Rot, Isotyp-Antikörperkontrolle; Blau, Kontrollzellen + Anti-GMCSF-Antikörper; Grüne, GPI-GIFT4-exprimierende Zellen + Anti-GMCSF-Antikörper.

VLPs wurden mithilfe des rBV-Expressionssystems in Insektenzellen hergestellt. Die Proteinzusammensetzung der resultierenden VLPs wurde durch Western Blot unter Verwendung von für Gag, Env oder GM-CSF spezifischen Antikörpern charakterisiert. Wie in Abb. 2a (a.2) gezeigt, wurde beobachtet, dass das in Standard-Env/Gag-VLPs (sVLPs, Spur 2) oder cVLPs (Spur 4) eingebaute Env eine Molekularmasse von etwa 120 kDa aufwies19. Eine Bande, die mit der erwarteten Größe von GPI-GIFT4 wanderte, wurde in cVLP- und GIFT4/Gag-VLPs beobachtet (Spuren 3 und 4 in a.3), was den Einbau von GPI-GIFT4 in diese VLPs zeigt. Die in Spur 4 von a.2 und a.3 in Abb. 2a gezeigten Ergebnisse zeigen weiter, dass membranverankertes GIFT4 und Env gemeinsam in HIV-cVLPs eingebaut werden können. Um zu überprüfen, ob die Integration von GIFT4 in VLPs durch die GPI-Verankerung auf der Membranoberfläche erfolgt, wurde ein FACS-Assay durchgeführt. GIFT4 wurde durch die erhöhte Fluoreszenzintensität in cVLPs (grüne Kurve in Abb. 2b), nicht jedoch in sVLPs (blaue Kurve in Abb. 2b) nach Anti-GM-CSF-Antikörperfärbung nachgewiesen. Darüber hinaus wurde das GIFT4-Signal von cVLPs durch die Behandlung mit PIPLC, einer Phosphatidylinositol-spezifischen Phospholipase, die GPI-verankerte Moleküle aus Membranen freisetzt, vollständig eliminiert22, wie in Abb. 2b (rote Kurve) gezeigt. Zusammengenommen zeigten diese Daten, dass GIFT4 durch GPI-Verankerung in VLPs eingebaut oder in cVLPs miteingebaut werden kann.

Charakterisierung von VLPs.

a, Western-Blot-Analyse der Proteinkomponenten von VLPs. VLP-Proben mit 1 μg Gesamtprotein wurden für die SDS-PAGE geladen, gefolgt von Western Blot. Proteinbanden wurden untersucht mit: a.1, Anti-HIV-Gag-Antikörper; a.2, polyklonale Anti-gp120-Antikörper; a.3, Anti-GM-CSF-Antikörper. Spur 1, nur Gag-VLPs; Spur 2, sVLPs; Spur 3, GIFT4/Gag-VLPs; Spur 4, cVLPs; M, Molekulargewicht (kDs). b: FACS-Analyse der GIFT4-GPI-Verankerung in VLPs unter Verwendung von Anti-GM-CSF-Antikörpern. VLP-Proben (1 ml bei 1 mg/ml) wurden für die Antikörperfärbung verwendet, wie für die Zelloberflächenfärbung in Abbildung 1 beschrieben. Blau, sVLPs; Grün, cVLPs; Rot, cVLPs nach der PIPLC-Behandlung. c, Proliferation von Meerschweinchen-Splenozyten in vitro, stimuliert durch VLPs oder GIFT4. Aus Meerschweinchen isolierte Milzzellen wurden 2 Tage lang in Gegenwart von 1 μg/ml verschiedener HIV-VLPs oder des löslichen GIFT4 (50 ng/ml) in vitro kultiviert und unter einem EVOS-Mikroskop fotografiert. C.1 bis c.5, mit PBS, löslichem GIFT4, sVLPs, GIFT4/Gag-VLPs bzw. cVLPs behandelte Zellen. Maßstabsbalken, 1000 μm.

Um festzustellen, ob in VLPs eingebautes GPI-GIFT4 noch seine funktionelle Aktivität beibehält, haben wir die Wirksamkeit von cVLPs bei der Induktion der Proliferation von Milzlymphozyten von Meerschweinchen in vitro getestet. Wie in Abb. 2c gezeigt, proliferierten nach zweitägiger Kultivierung in Gegenwart von 1 μg/ml cVLPs oder GIFT4/Gag-VLPs deutlich mehr Milzzellen zu Kolonien mit größeren Koloniegrößen (c.4 und c.5). im Vergleich zur Kontrolle (c.1) oder den sVLPs (c.3). Proliferation wurde auch in sVLP-behandelten Zellen (c.3) beobachtet, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu dem der GIFT4-haltigen VLPs (c.3). .4 und c.5 in Abb. 2c), was zeigt, dass VLPs selbst auch Lymphozytenstimulatoren sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass in VLPs eingebautes GPI-GIFT4 die biologische Aktivität des löslichen GIFT4 bei der Stimulierung der Lymphozytenproliferation beibehält20.

Um zu untersuchen, ob in HIV-VLPs eingebautes GIFT4 die Antikörperreaktionen gegen das Env-Immunogen verstärkt, wurden Gruppen von Meerschweinchen mit einer intramuskulären (im) Grundierung gefolgt von zwei intranasalen (in) Auffrischungen mit sVLPs, cVLPs, GIFT4/Gag-VLPs oder nur Gag-VLPs immunisiert , jeweils. Die für HIV Env spezifischen Immunserum-IgG-Spiegel wurden 2 Wochen nach jeder Immunisierung mittels ELISA bestimmt. Die in Abb. 3a gezeigten Ergebnisse (dargestellt als Endpunkttiter) zeigen, dass cVLPs Serumantikörperreaktionen mit höheren Titern induzierten als die, die bei sVLPs beobachtet wurden (P < 0,05). Nach drei Immunisierungen (Entnahme 3 in Woche 10, Abb. 3a) zeigten mit cVLPs immunisierte Meerschweinchen fünfmal höhere IgG-Spiegel als die durch sVLPs induzierten (Mittelwert 24600 vs. 4666, P < 0,01). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der gleichzeitige Einbau des membranverankerten GIFT4 in VLPs die Anti-Env-Immunantworten hochwirksam verstärkt. Obwohl cVLPs erhöhte IgG-Reaktionen induzierten, wurde Env-spezifisches IgA in Immunseren nicht nachgewiesen.

Serum-IgG- und IgG-Subtyp-Endpunkttiter.

Meerschweinchen wurden mit Nur-Gag-VLPs, GIFT4/Gag-VLPs, sVLPs oder cVLPs im Ein-Priming-Zwei-in-Boosting-Verfahren in den Wochen 0, 4 bzw. 8 immunisiert, und Immunseren wurden 2 Wochen nach jeder Immunisierung in den Wochen 2 gesammelt , 6 bzw. 10. a, Serum-IgG-Endpunkttiter; b, IgG1-Titer von Immunseren aus Blutung 3 (Woche 10); c, IgG2-Endpunkttiter von Immunseren aus Blutprobe 3. Die Tests wurden wie unter „Materialien und Methoden“ beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. Für die statistische Analyse wurde der Student-T-Test verwendet. Die Analyse wurde mit GraphPad Prism Version 5.00 für Windows (San Diego, Kalifornien) durchgeführt. P-Werte von weniger als 0,05 (P < 0,05) wurden als statistisch signifikant angesehen. *P < 0,05; **P < 0,01.

Wir untersuchten die Serum-IgG-Subklassenprofile in den Seren der Blutentnahme 3 und beobachteten, dass sVLPs und cVLPs sowohl IgG1- als auch IgG2-Immunantworten induzierten. Das IgG2/IgG1-Verhältnis beträgt für die sVLP-Gruppe etwa 9 und für die cVLP-Gruppe etwa 7 (Abb. 3b und c). Basierend auf diesen Daten kamen wir zu dem Schluss, dass IgG2 die IgG-Reaktionen auf HIV-VLPs dominiert. Im Vergleich zu IgG1 und G2 ist G3 viel niedriger, obwohl IgG3 in dieser Studie aufgrund des Fehlens eines kommerziellen Anti-IgG3-Antikörpers nicht gemessen wurde. Im Gegensatz zu den menschlichen IgG-Subtypen einschließlich G1, G2, G3 und G4 haben Meerschweinchen keinen Subtyp IgG4. Obwohl cVLPs im Vergleich zu sVLPs höhere IgG-Titer induzierten, zeigen ihre Antikörperreaktionen ähnliche IgG-Subtypprofile.

Die verwendete Sequenz von GIFT4 wurde von Mäusen abgeleitet20. Daher wollten wir wissen, ob bei Meerschweinchen für GIFT4 spezifische Antikörperreaktionen induziert wurden und ob diese Antikörper die Adjuvansfunktion von GIFT4 bei nachfolgenden Immunisierungen verringern. Allerdings konnten wir in Immunseren keine GIFT4-spezifischen Antikörper beobachten (Daten nicht gezeigt).

Es ist allgemein bekannt, dass die Schleimhautimmunität für die Kontrolle einer primären HIV-1-Infektion unerlässlich ist. In der vorliegenden Studie verwendeten wir ein Immunisierungsschema, das eine Im-Prime-Impfung, ergänzt durch zwei In-Boosts, enthielt, von der erwartet wurde, dass sie verstärkte mukosale Immunantworten hervorruft. Um festzustellen, ob cVLPs durch dieses Immunisierungsschema verstärkte mukosale Immunantworten auslösen, haben wir nach drei Immunisierungen die sekretorischen Env-spezifischen IgA- und IgG-Spiegel im Speichel und in Vaginalspülungen untersucht. Wie in Abb. 4a, b gezeigt, waren sowohl die Env-spezifischen IgG- als auch die IgA-Titer in Speichelproben in der cVLP-Gruppe viel höher als in der sVLP-Gruppe. Bemerkenswerterweise zeigten cVLP-immunisierte Meerschweinchen in Woche 10 auch etwa 5-fach höhere IgG-Spiegel (Abb. 4c) und 6-fach höhere IgA-Spiegel (Abb. 4d) in Vaginalspülungen als bei sVLP-immunisierten Meerschweinchen. Dies zeigt, dass GIFT4 ein wirksames Adjuvans zur Auslösung mukosaler Immunantworten ist.

Endpunkttiter der Schleimhautantikörper.

Schleimhautproben wurden in Woche 12, also 4 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung, entnommen. Env-spezifische IgG- und IgA-Endpunkttiter wurden durch ELISA wie in Materialien und Methoden beschrieben nachgewiesen. a, Speichel-IgG; b, Speichel-IgA; c, vaginales IgG; d, vaginales IgA. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt. *P < 0,05; **P < 0,01.

Die Antikörperaffinität für das HIV-Antigen ist im Frühstadium der Infektion gering und nimmt mit fortschreitender Infektion zu, während die Antikörper reifen23. Während der Reifung bilden sich neutralisierende Antikörper mit erhöhter Avidität. Nach wiederholter Antigen-Exposition wurde über einen signifikanten Anstieg der Avidität berichtet24. Mehrere neuere Studien haben auch Korrelationen zwischen der Avidität nicht neutralisierender Antikörper und der HIV-Schutzwirkung gezeigt25,26,27. Daher ist die Antikörper-Aviditätsanalyse eine wirksame Methode zur Bewertung der Antikörperqualität im Hinblick auf die Bereitstellung von Schutz. Um festzustellen, ob cVLPs Antikörperreaktionen auf Env mit erhöhter Avidität auslösen, wurden sechs Env-pseudotypisierte Viren aus den Klassen B und C verglichen. Da Env in die pseudovirale Hülle eingefügt wird, wie es bei Virionen der Fall ist, sind Env in Pseudoviren und Virionen funktionell gleichwertig, indem sie an Zielzellen binden und die Membranfusion von Virus und Wirtszelle vermitteln. Neutralisierungstests auf Basis pseudotypisierter Viren wurden in großem Umfang verwendet, um die Fähigkeit von Antikörpern zur Blockierung einer HIV-Infektion zu bewerten. Daher sollte die Antikörperaffinität gegenüber dem Pseudovirus Env die Antikörperbindung an HIV-Partikel widerspiegeln. Die in Abb. 5 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass Serumantikörper in der cVLP-Gruppe im Vergleich zu den Seren aus der sVLP-immunisierten Gruppe eine deutlich erhöhte Avidität zeigten. Wie in Abb. 5 gezeigt, lösten die cVLPs Antikörper mit erhöhter Avidität mit AIs um 40 für die Bindung an 4 der 6 Clade-B-Stämme (Abb. 5a) sowie 4 der 6 Clade-C-Viren (Abb. 5b) aus, verglichen mit sVLPs mit AIs von nicht mehr als 20 (P < 0,05). Mittlere Grade der Aviditätssteigerung wurden bei Stamm 6535.3 in Klade B und ZM214M.PL15 in Klade C festgestellt, und bei AC10.0.29 in Klade B oder ZM109F.PB4 (Klade C) wurde keine Veränderung beobachtet (P > 0,05). Obwohl cVLPs wie oben beobachtet eine erhöhte Avidität gegenüber sVLPs hervorriefen, unterschied sich interessanterweise die Avidität gegenüber Envs zwischen diesen Stämmen nicht signifikant. Aufgrund der viel geringeren Antikörperkonzentration in Schleimhautproben war eine Avidität sowohl von IgG als auch von IgA in Schleimhautproben nicht nachweisbar, wie dies bei Serum-IgA der Fall ist.

Avidität von Immunserum-IgG gegenüber ausgewählten Pseudoviren.

Aviditätstests wurden mit Immunseren aus Blutabnahme 3 (in Woche 10) von sVLP- und cVLPs-immunisierten Meerschweinchen durchgeführt. a, Aviditätsindizes von Immunserum-IgG gegenüber Clade-B-Pseudoviren; b, Aviditätsindizes von Immunserum-IgG gegenüber Clade-C-Pseudoviren. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. *P < 0,05.

Neutralisierende Antikörper können eine Virusinfektion direkt blockieren, indem sie fest an das funktionelle Env binden, Eintrittshemmung, Virusaggregation, komplementabhängige Inaktivierung vermitteln oder eine antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität/Virushemmung (ADCC/ADCVI) auslösen28,29,30 und Daher sind sie ideale Ziele, die durch einen Impfstoff hervorgerufen werden können. Unsere Ergebnisse zeigen, dass HIV-cVLPs, die GPI-verankertes GIFT4 enthielten, im Vergleich zu sVLPs höhere IgG-Titer induzierten. Wir haben die Neutralisierungsreaktivität dieser Antikörper weiter untersucht, indem wir eine Reihe von Env-Pseudoviren der HIV-Klassen B und C verwendet haben. Dabei handelte es sich um dieselbe Virusgruppe, die zum Vergleich der Antikörperbindungsaffinität in Abb. 5 verwendet wurde. Wie in Abb. 6a gezeigt, wurde eine neutralisierende Reaktivität im Serum hervorgerufen von der cVLP-Gruppe gegen PVO.4, ein Tier-3-Virus, das eine starke Neutralisierungsresistenz zeigt31 und RHPA4259.7 (Stufe 2) wurden verstärkt (ungefähr 30–40 % der Viren wurden auf weniger als 20 neutralisiert, P < 0,05) im Vergleich zur sVLP-Gruppe. Von den 6 getesteten Clade-C-Viren zeigten Immunseren aus der cVLP-Gruppe eine verstärkte Neutralisierung gegenüber Du156.12 (Stufe 2), ZM214M.PL15 (Stufe 2) und ZM109F.PB4 (mittel) im Vergleich zur sVLP-Gruppe (P < 0,05). (Abb. 6b). GIFT4-haltige VLP- und sVLP-Gruppen zeigten ähnliche Neutralisationstiter wie die anderen Viren (P > 0,05). Diese Ergebnisse deuten außerdem auf eine adjuvante Wirkung des membranverankerten GIFT4 in cVLPs hin, indem es Antikörperreaktionen mit erhöhter Neutralisierungsbreite und -stärke induziert.

Neutralisierende Aktivität.

Immunseren der Blutprobe 3 von sVLPs und cVLP-immunisierten Tieren wurden auf neutralisierende Aktivität getestet. Der endgültige Verdünnungsfaktor der Immunseren betrug das 40-fache. a, Neutralisierung gegen Pseudoviren der Klasse B. b, Neutralisierung gegen Clade-C-Pseudoviren. Die Daten wurden als Mittelwerte ± Standardabweichungen ausgedrückt. *P < 0,05.

Ein Hauptziel von Impfstoffen gegen HIV besteht darin, Immunreaktionen auf der Ebene der Schleimhautoberfläche auszulösen, um die Übertragung zu blockieren, sowie in systemischen Kompartimenten, um disseminierte Viren zu beseitigen. Systemisch verabreichte Impfstoffe stimulieren im Allgemeinen keine starken mukosalen Immunreaktionen. In der vorliegenden Studie haben wir cVLPs mit effizientem gleichzeitigem Einbau von HIV Env zusammen mit einem neuartigen Fusokin, GIFT4, als co-stimulierenden Faktor in dieselben Partikel entwickelt. Die resultierenden cVLPs wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, verstärkte Antikörperreaktionen in systemischen Kompartimenten sowie auf Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Diese Studie integriert mehrere Ansätze zur Verbesserung der HIV-Immunantwort. Dazu gehören: 1) verstärkter Einbau von Env in VLPs, um die Dichte von Immunogenen zu erhöhen; 2) Konstruktion und gemeinsamer Einbau einer membrangebundenen Form von GIFT4 in cVLPs zur weiteren Verbesserung der Immunogenität durch Stimulierung der B-Lymphozyten-Proliferation und -Aktivierung; 3) Einsatz eines systemischen Prime/Schleimhaut-Boost-Wegs, um sowohl systemische als auch mukosale Immunantworten auszulösen. Basierend auf den vorliegenden Ergebnissen hat diese integrierte HIV-Impfstoffstrategie das Potenzial, in Zukunft weiterentwickelt zu werden, um einen prophylaktischen HIV-Impfstoff herzustellen.

Die meisten aktuellen Impfstoffe werden durch intramuskuläre Injektion verabreicht und lösen systemische Immunreaktionen aus. Eine Schleimhautimmunität wird jedoch selten durch eine systemische Immunisierung induziert. Da die Übertragung über die Schleimhäute der vorherrschende Übertragungsweg für HIV-Infektionen ist und weltweit bis zu 80 % der AIDS-Inzidenz ausmacht32, ist die Funktion der Immunität an den Eintrittspforten der Schleimhäute äußerst wichtig, um eine primäre HIV-1-Infektion zu verhindern. Aufgrund der relativ geringen Effizienz der HIV-Infektion an Schleimhautoberflächen könnte selbst eine geringfügige Verstärkung der durch Antikörper vermittelten schützenden Immunantworten der Schleimhäute einen erheblichen Effekt auf die Verringerung der Krankheitsinzidenz haben7. Daher muss ein wirksamer HIV-Impfstoff möglicherweise sowohl eine Schleimhautimmunität induzieren, um die Häufigkeit der Erstinfektion zu verringern, als auch möglicherweise das Entweichen des Virus aus der Genital- und Darmschleimhaut in die systemischen Lymphorgane blockieren und eine systemische Immunität, wie beispielsweise weitgehend neutralisierende Antikörperreaktionen, um jegliche Infektionen zu beseitigen verbreitetes Virus. In der vorliegenden Studie wurde der intramuskuläre primär-intranasale Boost-Immunisierungsweg eingesetzt, um eine Verstärkung der Immunität sowohl in systemischen Kompartimenten als auch auf Schleimhautoberflächen zu induzieren.

Frühere Studien haben die Bedeutung der Nasenhöhle für die Auslösung sowohl mukosaler als auch systemischer Immunantworten aufgrund des Vorhandenseins von Keimzentren mit B-, T-, Plasma- und professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) nahegelegt33. Es ist außerdem gut belegt, dass strategisch an der Eintrittsstelle der Atemwege und des Verdauungstrakts positionierte Lymphgewebe für die Antigenaufnahme wichtig sind. Durch zwei Boosts mit den neu konstruierten cVLPs wurden im Vergleich zu sVLPs, die auf demselben Weg verabreicht wurden, stark erhöhte mukosale HIV-Env-spezifische IgG- und IgA-Spiegel induziert. Es ist bekannt, dass die in das Lumen sezernierten Antikörper eine immunologische Barriere bilden, um das Eindringen von Antigenen in die Schleimhäute zu begrenzen, und sind stark mit dem Schutz vor einer HIV-1-Infektion verbunden34,35,36. Obwohl bei mit cVLPs immunisierten Tieren robuste Schleimhaut-IgA- und IgG-Reaktionen beobachtet wurden, war Serum-IgA nicht nachweisbar. Da IgG in Immunseren gegenüber IgA vorherrschend ist und IgA bei der Bindung an dasselbe Epitop in Beschichtungsantigenen im ELISA verdrängen kann, kann nicht nachweisbares IgA darauf hinweisen, dass dieser Antikörper entweder fehlt oder in niedrigen Titern in Immunseren vorkommt. In einer kürzlich durchgeführten Analyse von Immunkorrelaten in der RV144-Studie wurde festgestellt, dass die IgA-Spiegel im Serum umgekehrt mit dem HIV-Schutz korrelieren37. Niedrige Serum-IgA-Spiegel in Immunseren können daher eine vorteilhafte Folge der durch GIFT4-haltiges VLP induzierten Immunität sein.

Eine ideale Antikörperantwort sollte nicht nur hohe Antikörpertiter, sondern auch eine hohe Antikörperavidität sowie neutralisierende Aktivität umfassen24,25,26,27. Wir beobachteten eine erhöhte Antikörper-Avidität sowie eine neutralisierende Breite und Wirksamkeit in der cVLP-immunisierten Gruppe, was die Schlussfolgerung stützt, dass die adjuvante Wirkung von GPI-GIFT4 es dem Immunsystem ermöglicht, in Env befindliche B-Zell-Epitope effektiver zu verarbeiten oder zu präsentieren. Obwohl kein Zusammenhang zwischen Antikörper-Avidität und Neutralisierung erkennbar war, könnte die beobachtete erhöhte Avidität auf nicht neutralisierende Antikörper zurückzuführen sein. Andere neuere Studien haben ebenfalls Zusammenhänge zwischen der Avidität nicht neutralisierender Antikörper und der HIV-Schutzwirkung gezeigt25,26,27. Die anderen verschiedenen Mechanismen können auch an der antiviralen Funktion der Immunität beteiligt sein, wie z. B. ADCC und T-Zell-Reaktion an Schleimhautstellen, einschließlich Darm und rektalen/vaginalen Schleimhautgeweben, um das Eindringen des Virus zu verhindern, die Replikation des entwichenen Virus einzudämmen und die Ausbreitung zu verzögern eine systemische Infektion38,39,40,41,42 . Die Studie konzentrierte sich hauptsächlich auf Antikörperreaktionen (Spiegel, Avidität und neutralisierende Wirksamkeit), da festgestellt wurde, dass die Gain-of-Function-Aktivität von GIFT4 B-Zell-Reaktionen erleichtert20.

GM-CSF hat sich in mehreren Studien als wirksames Adjuvans für HIV-Impfstoffe erwiesen. Bei Rhesusaffen wurden Anti-Env-Antikörper mit verbesserter Avidität durch die gleichzeitige Abgabe von GM-CSF-DNA mit Gag-, Pol- und Env-DNA gefolgt von einem MVA-Boost13 hervorgerufen. Die mit Adjuvans behandelte Gruppe zeigte eine bessere Kontrolle der Belastung und der erneut auftretenden Virusinfektion13. Darüber hinaus sind APCs wichtig, um eine robuste Immunantwort auszulösen. Frühere Studien haben gezeigt, dass GM-CSF in Kombination mit IL-4 das Wachstum menschlicher DCs in vitro optimiert17. Es ist bekannt, dass beide Zytokine die Differenzierung und Reifung nicht wachsender menschlicher Blutmonozyten oder proliferierender Vorläufer aus dem Knochenmark fördern43. Die Mechanismen, die den verstärkten Immunantworten zugrunde liegen, die in den oben genannten und den vorliegenden Studien beobachtet wurden, könnten eng mit der Rolle von GM-CSF und IL-4 oder seinem Funktionsgewinn von GIFT4 bei der Förderung der Differenzierung und Reifung von Monozyten zusammenhängen in dendritische Zellen (DC)16. Im Gegensatz zu einzelnen Zytokinen oder deren Mischung können künstlich hergestellte Fusokine neuartige Funktionen als Stimulatoren von Lymphozyten erzeugen, wie bereits gezeigt20,44,45. Es wurde festgestellt, dass GIFT4 eine Gain-of-Function-Aktivität erzeugt, die eine robuste B-Zell-Proliferation induziert und zu verstärkten B-Zell-Reaktionen führt20. Durch die weitere Kopplung eines GPI-Ankers, um den gemeinsamen Einbau von GIFT4 in VLPs zusammen mit Env zu ermöglichen, kann der integrierte Antigen-Stimulator in denselben cVLPs gezielte Immunzellen für eine bessere Antigenpräsentation und -proliferation bereitstellen. Die verbesserte adjuvante Wirksamkeit durch den gleichzeitigen Einbau eines Immunstimulators in VLPs im Vergleich zum Mischen mit VLPs wurde bereits zuvor nachgewiesen46,47,48. Die starke Proliferation von Env-primierten B-Zellpopulationen, die durch GIFT4 stimuliert wurden, könnte ein wichtiger Faktor für die verstärkten Antikörperreaktionen bei cVLPs-immunisierten Tieren in der vorliegenden Studie sein. Da GIFT4 außerdem von Zytokinen (GM-CSF und IL-4) abgeleitet ist, ist es äußerst sicher, wenn es als molekulares Adjuvans verwendet wird.

In dieser Studie wird der große Wert von GPI-verankertem GIFT4 in VLPs als neuartiges Adjuvans durch verbesserte systemische und mukosale Antikörperreaktionen mit erhöhter Avidität und erweiterter Neutralisierungskapazität untermauert. Diese Daten belegen das Potenzial von GIFT4-haltigen HIV-VLPs für die Entwicklung eines wirksamen HIV-Impfstoffs zur Verabreichung über den Im-Prime-In-Boosting-Immunisierungsweg. Der Einbau des membranverankerten GIFT4 kann ein allgemeiner Ansatz zur Verbesserung der Immunogenität verschiedener VLP-Impfstoffe sein.

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Meerschweinchenstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Emory University genehmigt. Das IACUC hat für diese Studie die Protokollnummer 079-2008Y herausgegeben. Weibliche Meerschweinchen (8 Wochen alt) wurden vom Jackson Laboratory gekauft und in der Tierhaltung der Emory University untergebracht. Impfungen und Blutungen wurden unter Narkose durchgeführt, die mit Ketaminhydrochlorid und Xylazin eingeleitet und aufrechterhalten wurde, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden zu minimieren.

Um ein Gen zu erzeugen, das für das membranverankerte GIFT4 kodiert, wurden die kodierenden Sequenzen des Signalpeptids aus dem Honigbienen-Melittin und der Maus-CD59-GPI-Anker mit den 5′- und 3′-Enden des GIFT4-kodierenden Gens (abgeleitet von Maussequenzen) fusioniert20) im Rahmen, um das kodierende Gen in voller Länge eines GPI-verankerten GIFT4 (GPI-GIFT4) durch überlappende PCR20,49,50,51 zu erhalten. Das resultierende GPI-GIFT4-kodierende Gen wurde dann in das Transfervektor-pFastBac-1-Plasmid (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. Ein rekombinantes Baculovirus (rBV), das GPI-GIFT4 exprimiert, wurde unter Verwendung des Bac-to-Bac-Insektenzellproteinexpressionssystems (Invitrogen, Carlsbad, CA) erzeugt.

Um zu bestätigen, ob GPI-verankertes GIFT4 membranorientiert transloziert und auf Zelloberflächen exprimiert werden kann, wurden SF9-Zellen mit rBVs infiziert, die GPI-GIFT4 mit einer MOI von 2 exprimierten. Zwei Tage später wurden die Zellen geerntet und mit Ratten-Anti-Maus-GM gefärbt -CSF-Antikörper (BD Biosciences), gefolgt von PE-konjugierten Sekundärantikörpern. Als Antikörperkontrolle diente ein nicht mit GIFT4 verwandter Ratten-Anti-Maus-Antikörper. Sf9-Zellen, die mit rBVs infiziert waren, die Env exprimierten, wurden mit Anti-GM-CSF gefärbt, gefolgt von PE-konjugierten Sekundärantikörpern als weitere Kontrolle. Die Fluoreszenzintensität wurde durch FACS mit einem BD FACSCanto II-Durchflusszytometer aufgezeichnet und analysiert.

Vier verschiedene VLPs (nur Gag-VLPs, GIFT4/Gag-VLPs, sVLPs und cVLPs) wurden zum Vergleich unter Verwendung eines Insektenzell-Expressionssystems wie zuvor beschrieben19 hergestellt. Für die Produktion von cVLPs wurden sf9-Zellen mit drei rBVs koinfiziert, die jeweils einen modifizierten HIV-Env-Konsensus (ConS) exprimierten, der einen hohen Grad an Einbau in VLPs, GPI-GIFT4 und Gag, bei MOIs von 6, 2 und 3 zeigte. bzw.3,19. Standard-VLPs und reine Gag-VLPs wurden wie beschrieben hergestellt19. GIFT4/Gag-VLPs wurden durch Koinfektion von sf9-Zellen mit rBVs produziert, die GPI-GIFT4 und Gag bei MOIs von 2 bzw. 3 exprimierten. Zwei Tage nach der Infektion wurde der Kulturüberstand gesammelt und die VLPs durch poröse Faserfiltration unter Verwendung des Quixstand-Tischsystems (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) konzentriert, gefolgt von einer Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, wie zuvor beschrieben50. Um die Ausbeute an gereinigten VLPs zu quantifizieren, wurde die Proteinkonzentration jeder Probe mithilfe des Bio-Rad-Proteintests (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA) geschätzt.

Um festzustellen, ob das in cVLPs verankerte GIFT4 die biologische Aktivität von löslichem GIFT4 beibehält, haben wir getestet, ob cVLPs in vitro die Proliferation von Milzzellen von Meerschweinchen induzieren können. Die Milzzellen wurden in vollständigem RPMI-Medium in Gegenwart von 1 μg/ml sVLPs, cVLPs bzw. GIFT4/Gag-VLPs kultiviert. Als Positivkontrolle wurde lösliches GIFT4 (50 ng/ml) verwendet. Nach zweitägiger Inkubation bei 37 °C in 5 % CO2 wurde die Zellproliferation beobachtet und unter einem EVOS-Mikroskop (Life Technologies, Grand Island, NY) abgebildet.

Weibliche Meerschweinchen vom Stamm Hartley wurden vom Charles River Laboratory (Wilmington, MA) erhalten und in vier Gruppen aufgeteilt (5 Tiere pro Gruppe). Die Gruppen wurden mit einem Immunisierungsschema immunisiert, das eine intramuskuläre (im) Grundimmunisierung, gefolgt von zwei intranasalen (in) Auffrischungsimpfungen mit VLP-Impfstoffen im Abstand von 4 Wochen umfasste. Für jede Immunisierung wurden Tiere in den Gruppen „Nur Gag“ und „GIFT4/Gag VLP“ mit jeweils 100 μg Gesamtprotein immunisiert. Standard- und cVLPs wurden in Dosen verabreicht, die jeweils 10 μg Env enthielten. Im Durchschnitt enthielt eine Dosis GIFT4-haltiger VLPs (cVLPs und GIFT4/Gag-VLPs) etwa 2 μg GIFT4, kalibriert unter Verwendung von löslichem GIFT4. Zwei Wochen nach jeder Immunisierung wurden Immunseren durch Vena-Cava-Blutung anästhesierter Meerschweinchen gesammelt.

Schleimhautproben wurden in Woche 12, also 4 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung, entnommen. Vaginale Spülungen wurden durch intravaginale Spülung von 250 μl PBS mit einer oralen Ernährungsnadel (Braintree Scientific Inc., Braintree, MA) gesammelt52. Um Speichelproben zu sammeln, wurden vorgewogene Q-Tips aus medizinischer Baumwolle in den Mund eingeführt und 5 Minuten lang belassen, dann gewogen und mit PBS plus 0,02 % Tween 20 extrahiert. Die Proben wurden kurz zentrifugiert und die Überstände durch einen 0,22-μm-Filter filtriert und zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.

Um HIV-Env-spezifische IgG-, IgG1-, IgG2- und IgA-Antikörperreaktionen zu bestimmen, wurden ELISA-Platten (Nunc-Immuno Plate MaxiSorp™, Nunc Life Technologies, Basel, Schweiz) mit ConS Env gp120 beschichtet, das aus 293T-Zellen gereinigt wurde, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus3 infiziert waren. 19. Der höchste Verdünnungsfaktor, der eine OD 450 ergibt, die doppelt so hoch ist wie die der naiven Probe bei der Verdünnung, wurde als Antikörper-Endpunkttiter bezeichnet.

Jedes der sechs env-Expressionsplasmide aus einem NIH-Standardreferenzpanel für Klade B bzw. C wurde ausgewählt, um Env-pseudotypisierte Viren für Bindungs-Aviditäts- und Neutralisierungstests zu erzeugen. Zu diesen Tier-2/3-Viren gehörten 6535.3, PVO.4, AC10.0.29, TRJO4551.58, RHPA4259.7 und CAAN5342.A2 in Clade B sowie Du156.12, Du422.1, ZM214M.PL15, ZM249M.PL1, ZM109F. PB4 und CAP45.2.00.G3 in Klade C53,54.

Pseudoviren wurden durch Transfektion von 293T-Zellen (6–8 × 106 Zellen in 15 ml Wachstumsmedium in einer T-75-Zellkulturflasche) mit 10 μg eines spezifischen env-Expressionsplasmids und 10 μg des env-defizienten HIV-1-Rückgratvektors hergestellt (pSG3△Env) unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen). In den Kulturüberständen enthaltene Pseudoviren wurden 2 Tage nach der Transfektion geerntet und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Die 50 % ige Gewebekultur-Infektionsdosis (TCID50) jedes Pseudovirus wurde gemessen und die Proben wurden zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.

Neutralisationstests wurden in JC53-BL-Zellen wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt3. Kurz gesagt, JC53-BL-Zellen wurden 24 Stunden vor der Infektion mit 25.000 Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Meerschweinchenserumproben wurden 30 Minuten lang bei 56 °C hitzeinaktiviert und 1:20 in 10 % FCS-DMEM auf ein Endvolumen von 25 μl verdünnt und zu 25 μl Pseudovirus-Stammlösung hinzugefügt, verdünnt in 10 % FCS-DMEM mit 50 infektiöse Partikel (endgültige Serumverdünnung, 1:40). Als Kontrollen dienten nur mit Medium gemischte Viren. Die Virus-Immunserum-Mischungen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert und dann mit DEAE-Dextran in einer Endkonzentration von 15 μl/ml zu JC-53-Zellen gegeben. Nach 2-stündiger Inkubation wurden weitere 200 μl komplettes DMEM hinzugefügt. Zwei Tage nach der Infektion wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden wie von Chackerian et al.55 beschrieben fixiert und gefärbt. Die neutralisierende Aktivität des Antikörpers wird als Prozentsatz der Neutralisierung dargestellt und als [(durchschnittliche Anzahl blauer Herde in Kontrollvertiefungen – durchschnittliche Anzahl blauer Herde in Probenvertiefungen mit Virus-Serum-Mischung)/(durchschnittliche Anzahl blauer Herde in Kontrollvertiefungen)] × 100 berechnet %.

Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 100 μl Env-Pseudovirionen (4 μg/ml) in Beschichtungspuffer (0,1 M Natriumcarbonat, pH 9,5) bei 4 °C über Nacht beschichtet, die verdünnten Serumproben wurden in die Vertiefungen gegeben und 1,5 Minuten lang inkubiert Stunden bei 37 °C. Der Assay wurde unter Verwendung paralleler Titrationen von Immunseren mit oder ohne Behandlung mit 1,5 M Natriumthiocyanat (NaSCN) für 15 Minuten durchgeführt, um nach der Bindung von Immunseren eine schwache Bindung von einer hochaffinen Bindung zwischen Antikörpern und Antigenen zu unterscheiden. Anschließend wurden die Antikörpertiter mit dem Standard-ELISA-Verfahren bestimmt. Der Aviditätsindex (AI) wurde berechnet, indem der Titer mit NaSCN-Behandlung durch den Titer ohne NaSCN-Behandlung dividiert und mit 10056,57 multipliziert wurde.

Zitierweise für diesen Artikel: Feng, H. et al. Der Einbau eines GPI-verankerten gentechnisch veränderten Zytokins als molekulares Adjuvans erhöht die Immunogenität von HIV-VLPs. Wissenschaft. Rep. 5, 11856; doi: 10.1038/srep11856 (2015).

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Wir danken Frau Ying-Chun Wang, Tamanna Ahmed und Dahnide Taylor Williams für die Laborunterstützung und Erin-Joi Collins für die administrative Unterstützung. Diese Studie wurde durch die NIH/NIAID-Zuschüsse AI10908 (RWC), AI116361 (BZW), AI093881 (JG) sowie den Winship Robbins Scholar Award und den Winship Melanoma Research Fund (JD) unterstützt.

Feng Hao und Zhang Han haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Emory Vaccine Center, Emory University, Atlanta, 30322, GA, USA

Hao Feng, Han Zhang, Li Wang, Yuan He, Shelly Wang, Roheila Seyedtabaei, Richard W. Compans und Bao-Zhong Wang

Abteilung für Hämatologie und Medizinische Onkologie, Winship Cancer Institute, Emory University, Atlanta, 30322, GA, USA

Jiusheng Deng und Jacques Galipeau

Abteilung für Bioingenieurwesen, Technische Universität Henan, Zhengzhou, 450052, China

Qing Wang & Laiting Liu

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RWC und BZW leiteten das Projekt. HF, LL und BZW konzipierten Immunisierungsexperimente. HF, HZ, LW, YH, SW und RS führten Immunisierungsexperimente durch. JD und JG führten Funktionsanalysen durch. QW und LL führten statistische Analysen durch. HF, HZ und BZW haben das Manuskript verfasst. JG, RWC und BZW haben das Manuskript überarbeitet.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Feng, H., Zhang, H., Deng, J. et al. Der Einbau eines GPI-verankerten gentechnisch veränderten Zytokins als molekulares Adjuvans erhöht die Immunogenität von HIV-VLPs. Sci Rep 5, 11856 (2015). https://doi.org/10.1038/srep11856

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Eingegangen: 20. Oktober 2014

Angenommen: 22. Mai 2015

Veröffentlicht: 07. Juli 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep11856

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