Die noradrenerge Konsolidierung des sozialen Erinnerungsgedächtnisses wird durch β vermittelt

May 27, 2023

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1097 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Gedächtnis sozialer Anerkennung (SRM) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung sozialer Beziehungen und die Erhöhung der Überlebensrate. Der mediale präfrontale Kortex (mPFC) ist ein wichtiger Gehirnbereich, der mit der SRM-Speicherung verbunden ist. Die Freisetzung von Noradrenalin (NE) reguliert die neuronale intrinsische Erregbarkeit und exzitatorische synaptische Übertragung von mPFC. Die Rolle der NE-Signalübertragung im Schaltkreis des Locus coeruleus (LC)-Signalwegs zum mPFC während der SRM-Speicherung ist jedoch unbekannt. Hier stellten wir fest, dass LC-mPFC NE-Projektionen die SRM-Konsolidierung bidirektional regulierten. Propranolol-Infusion und β-adrenerge Rezeptoren (β-ARs) oder β-Arrestin2-Knockout im mPFC störten die SRM-Konsolidierung. Bei der Injektion von Carvedilol, einem β-Blocker, der die durch β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung leicht aktivieren kann, zeigten die Mäuse keine signifikante Unterdrückung der SRM-Konsolidierung. Die durch β1-AR- oder β-Arrestin2-Knockout im mPFC verursachte beeinträchtigte SRM-Konsolidierung wurde durch die Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen nicht behoben; Allerdings wurde die beeinträchtigte SRM durch Hemmung von LC-mPFC-NE-Projektionen oder β1-AR-Knockout im mPFC durch Aktivierung des β-Arrestin-Signalwegs im mPFC wiederhergestellt. Darüber hinaus verbesserte die Aktivierung des β-Arrestin-Signals die SRM-Konsolidierung bei älteren Mäusen. Unsere Studie legt nahe, dass LC-mPFC-NE-Projektionen die SRM-Konsolidierung durch β-Arrestin-abhängige β-AR-Signale regulieren.

Das soziale Erkennungsgedächtnis (SRM) ist entscheidend für den Aufbau und die Aufrechterhaltung sozialer Beziehungen1, die für die Anpassung an die Umwelt, die Fortpflanzung und das Überleben2,3 von wesentlicher Bedeutung sind. Bei Nagetieren wird SRM anhand der Fähigkeit beurteilt, neue Artgenossen zu unterscheiden und gegenüber bekannten Artgenossen, denen man zuvor begegnet ist, zu bevorzugen. Wie bei anderen Formen des Lernens werden soziale Informationen erworben und gefestigt, wenn labile Spuren im Langzeitgedächtnis stabilisiert werden4. Die Mechanismen, die der SRM-Konsolidierung zugrunde liegen, sind unklar.

Der mediale präfrontale Kortex (mPFC) ist für ein breites Spektrum sozialer Verhaltensweisen von entscheidender Bedeutung1,5. Der mPFC ist in mehreren Neuroschaltkreisen enthalten, die für das soziale Gedächtnis von entscheidender Bedeutung sind, einschließlich der ventralen Hippocampus-mPFC-, Amygdala-mPFC- und olfaktorischen mPFC-Schaltkreise6,7,8. Infusionen von NMDA- oder AMPA/Kainat-Rezeptor-Antagonisten in den mPFC verhindern die SRM-Konsolidierung9. Diese Beweise legen nahe, dass die glutamaterge synaptische Übertragung im mPFC die sozialen Fähigkeiten und das Gedächtnis für soziale Anerkennung reguliert. Die neuronale Erregbarkeit im mPFC ist auch für das soziale Gedächtnis von entscheidender Bedeutung. Die erregenden Neuronen im mPFC bilden unterschiedliche Ensembles, die auf soziale Erkundung ausgerichtet sind und Informationen über soziale Ziele übermitteln10. Die Aktivierung erregender Neuronen im mPFC verringert die soziale Erkundung11. Die chemogenetische Aktivierung von mPFC-erregenden Neuronen in Shank3-defizienten Mäusen stellt die verringerte soziale Anerkennung wieder her12. Für die SRM-Konsolidierung ist die Proteinsynthese im mPFC erforderlich, nicht jedoch die soziale Anerkennung13. Noradrenalin (NE) ist ein häufiger Neuromodulator, der eine Schlüsselrolle bei Aufmerksamkeit, Wahrnehmung und Kognition spielt14. Die Noradrenalin-Neuronen im Locus coeruleus (LC), der Hauptquelle von NE im Zentralnervensystem, projizieren durch stark verzweigte axonale Arborisierung breit in das Vorderhirn, einschließlich des mPFC15,16. Patch-Clamp-Aufzeichnungen haben gezeigt, dass die NE-Freisetzung die intrinsische Erregbarkeit von mPFC-Neuronen erhöht17, die durch den Antagonisten des β-adrenergen Rezeptors (β-AR)18 blockiert wird. Die β-AR-Aktivierung erleichtert auch die postsynaptischen Reaktionen erregender Synapsen auf Pyramidenneuronen im mPFC19. Es bleibt jedoch unbekannt, ob das LC-mPFC-NE-System an SRM beteiligt ist und wie die NE-Signalisierung im mPFC zur SRM-Konsolidierung beitragen könnte.

β-ARs sind prototypische heterotrimere Guaninnukleotid-bindende Proteine ​​(G-Protein)-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die auf NE reagieren. Die Ligandenbindung induziert GPCR-Konformationsänderungen, die heterotrimere G-Proteine ​​rekrutieren, was zur Aktivierung der Adenylatcyclase führt. Darüber hinaus fördert die ligandenabhängige Phosphorylierung von GPCR die Rekrutierung von β-Arrestin, was eine Desensibilisierung des Rezeptors induziert20. Darüber hinaus kann β-Arrestin als Gerüstprotein fungieren und Signalwege unabhängig von G-Proteinen initiieren21. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass eine durch β-AR/β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung im entorhinalen Kortex die Wiederherstellung des Objekterkennungsgedächtnisses vermittelt22. Die Beiträge der durch G-Protein und β-Arrestin beeinflussten β-AR-Signalisierung im sozialen Gedächtnis sind jedoch weitgehend unbekannt.

Angesichts der obigen Überlegungen konzentrierte sich die vorliegende Studie auf die Rolle der noradrenergen LC-mPFC-Projektionen und β-ARs und ihrer nachgeschalteten Signalwege bei der SRM-Konsolidierung.

Um die Auswirkung von LC-mPFC NE-Projektionen auf die Speicherung des sozialen Gedächtnisses zu bestimmen, haben wir eine gut validierte Drei-Kammer-Gedächtnisaufgabe zur sozialen Erkennung angewendet23. Wir exprimierten eNpHR3.0-EYFP oder ChR2-mCherry in LC-NE-Neuronen in TH-Cre-Mäusen und entdeckten NE-Terminals im mPFC (EYFP+ oder mCherry+, Abb. 1a, b, g, h). Die optogenetische Hemmung des eNpHR3.0+ NE-Terminals24 im mPFC verringerte die NE-Freisetzung signifikant, während die optogenetische Aktivierung des ChrimsonR+ NE-Terminals24 im mPFC die NE-Freisetzung signifikant erhöhte (ergänzende Abbildung 1a – d). In der Gewöhnungssitzung, zu der auch die anfängliche Exposition gegenüber dem Dreikammerapparat gehörte, zeigten alle Mäuse eine ähnliche Präferenz für die beiden äußeren Kammern. Während der Trainingsphase (Geselligkeitstest) verbrachten die Mäuse deutlich mehr Zeit mit der Interaktion mit einer neuartigen Maus (N) über dem leeren Drahtkäfig (E) (ergänzende Abbildung 1e, f), was auf eine ähnliche Geselligkeit zwischen den beiden Gruppen hindeutet. Wir haben LC-mPFC-NE-Projektionen unmittelbar nach dem Geselligkeitstest selektiv stimuliert (Abb. 1a, g). Der SRM-Test wurde eine Stunde oder einen Tag, nachdem die Mäuse der neuartigen Maus ausgesetzt waren, durchgeführt und umfasste den Vergleich der Interaktionszeit mit der nun vertrauten Maus (F) mit der Interaktion mit einer zweiten neuartigen Maus (N). Die optogenetische Hemmung von LC-mPFC-NE-Projektionen25 änderte nichts an der Präferenz für die neue Maus im SRM-Test 1 (Abb. 1c, d); Es verringerte jedoch den Diskriminierungsindex im SRM-Test 2 (Abb. 1e, f), was darauf hindeutet, dass LC-mPFC-NE-Projektionen für Langzeit-SRM, nicht jedoch für Kurzzeit-SRM erforderlich sind. Darüber hinaus stellten wir bei der Dreikammer-SRM-Aufgabe fest, dass die optogenetische Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen nach dem Training die Erkundung der neuen Maus im einen Tag später durchgeführten SRM-Test nicht steigerte (Abb. 1i, j). SRM lässt schnell nach und bleibt bei Mäusen nur wenige Tage bestehen26. Als der SRM-Test 4 Tage nach dem Training durchgeführt wurde, erkundeten die Kontrollmäuse die neuartigen und bekannten Mäuse fast gleichermaßen, während die Mäuse mit Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen eine deutlich größere Präferenz für die neuartige Maus zeigten als die der Kontrollgruppe ( Abb. 1k, l), was darauf hindeutet, dass die Verstärkung der NE-Freisetzung im mPFC die Aufrechterhaltung des sozialen Gedächtnisses verlängert und die SRM-Konsolidierung fördert. Die Aktivierung von β-adrenergen Rezeptoren rekrutiert die extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK), was die langfristige Aufrechterhaltung der Potenzierung und die Bildung des Langzeitgedächtnisses erleichtert27. Daher untersuchten wir die pERK-Werte im mPFC nach dem Geselligkeitstest mit Laserstimulation. Wir fanden heraus, dass die Exposition gegenüber einer neuartigen Maus die pERK-Werte im mPFC im Vergleich zu Mäusen, die einer bekannten Maus oder dem leeren Drahtkäfig ausgesetzt waren, signifikant erhöhte (ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus unterdrückte die Hemmung der LC-mPFC-NE-Projektionen die ERK-Aktivierung im mPFC nach dem Geselligkeitstest (Abb. 1m, n). Die Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen erhöhte die ERK-Aktivierung im mPFC naiver Mäuse, steigerte die ERK-Aktivierung jedoch nach dem Geselligkeitstest nicht weiter (Abb. 1m, o). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LC-mPFC-NE-Projektionen die SRM-Konsolidierung durch adrenerge Downstream-Signale wie die ERK-Aktivierung regulieren könnten.

a, g Experimentelles Schema. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP oder AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry wurde in den LC von TH-Cre-Mäusen injiziert und optische Fasern wurden bilateral über dem mPFC implantiert. LC-mPFC NE-Projektionen wurden nach dem Training optisch stimuliert und SRM-Tests wurden 1 Stunde, 1 Tag oder 4 Tage nach dem Training durchgeführt. Nach dem Geselligkeitstest wurde ein Laser (590 nm, 10 mW, konstant für 10 Minuten; 473 nm, 5 mW, zwanzig 5-ms-Impulse bei 25 Hz, alle 5 s für die Dauer von 5 Minuten) abgegeben. b, h Repräsentative Bilder der Expression von eNpHR3.0-EYFP (b) oder ChR2-mCherry (h) im LC mit TH-Immunfärbung und optischer Faserspitze im mPFC. c, e, i, k Heatmaps des SRM-Tests. d, f, j, l Statistisches Diagramm der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [EYFP: n = 12, eNPHR3.0: n = 12. d Links: F-Maus × Virus ( 1, 22) = 1,628, p = 0,215, zweifaktorielle RM-ANOVA; Rechts: Z = 70.000, p = 0,931, Mann-Whitney-U-Test. f Links: F Maus × Virus (1, 22) = 9,398, p = 0,006, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: t (22) = 3,807, p < 0,001, zweiseitiger Student-t-Test. mCherry: n = 14, ChR2: n = 12. j Links: F Maus × Virus (1, 24) = 1,860, p = 0,185, zweifache RM-ANOVA; Rechts: t (24) = −1,664, p = 0,113, zweiseitiger Student-t-Test. l Links: F Maus × Virus (1, 24) = 11,904, p = 0,002, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: t (24) = −3,983, p < 0,001, zweiseitiger Student-t-Test]. m Experimentelles Schema. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP oder AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry wurde in den LC von TH-Cre-Mäusen injiziert. LC-mPFC NE-Projektionen wurden nach dem Geselligkeitstest optisch stimuliert. 15 Minuten nach dem Geselligkeitstest wurden die pERK-Werte im mPFC untersucht. n Repräsentative Western-Blots und Balkendiagramm für pERK-Spiegel im mPFC mit Hemmung der LC-mPFC-NE-Projektionen nach Geselligkeitstest [n = 7 für jede Gruppe. F-Sitzung × Virus (1, 24) = 6,863, p = 0,015, Zwei-Wege-ANOVA]. o Repräsentative Western Blots und Balkendiagramme für die pERK-Werte im mPFC mit Aktivierung der LC-mPFC NE-Projektionen nach dem Geselligkeitstest [n = 5 für jede Gruppe. F-Sitzung × Virus (1, 16) = 2,807, p = 0,113, Zwei-Wege-ANOVA]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ###p < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe. Maßstabsbalken: 100 μm.

Wir haben Adrb1 oder Adrb2 in den mPFC-glutamatergen Neuronen selektiv ausgeschaltet, indem wir AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre in den mPFC von Adrb1fl/fl- oder Adrb2fl/fl-Mäusen injiziert haben (Abb. 2a – f). Bei der Dreikammer-SRM-Aufgabe zeigten Mäuse mit halber oder vollständiger Deletion von β1-AR im mPFC eine verringerte Präferenz für die neue Maus im SRM-Test (Abb. 2g – i), während die Mäuse mit vollständiger Deletion, jedoch nicht Die halbe Deletion von β2-AR im mPFC zeigte eine beeinträchtigte Präferenz für die neue Maus im SRM-Test (Abb. 2j). Alle Mäuse zogen die neuartige Maus während des Geselligkeitstests dem leeren Käfig vor (ergänzende Abbildung 3a, b), was darauf hindeutet, dass die Deletion von β1-AR und β2-AR im mPFC die Geselligkeit nicht beeinträchtigte. Das selektive Ausschalten von β1-AR im mPFC hatte keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität (ergänzende Abbildung 3c). Es erhöhte jedoch das Angstniveau, was durch die verringerte Entfernung im zentralen Bereich und die geringere Zeit, die im zentralen Bereich während der Aufgabe im offenen Feld und auf der hellen Seite während der L/D-Box-Aufgabe verbracht wurde, belegt wurde (ergänzende Abbildung 3d– H). Das selektive Ausschalten von β2-AR im mPFC hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Fortbewegung oder das Angstniveau (ergänzende Abbildung 3i – n). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Mäuse mit β1-AR- oder β2-AR-Knockout im mPFC kein soziales Gedächtnis zeigen konnten, was darauf hindeutet, dass die mPFC-β-AR-Expression für die SRM-Konsolidierung erforderlich ist.

a, d AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre wurde in den mPFC von Adrb1fl/fl- oder Adrb2fl/fl-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern injiziert. b, e, c, f Repräsentative Bilder und statistische Diagramme der adrb1- und adrb2-mRNA-Spiegel im mPFC durch FISH. [c WT: n = 4 (3729 Zellen), Adrb1fl/fl: n = 4 (3503 Zellen), t (6) = 31,54, p < 0,001, zweiseitiger Student-t-Test; f WT: n = 4 (3192 Zellen), Adrb2fl/fl: n = 4 (3538 Zellen), t (6) = 3,543, p = 0,012, zweiseitiger Student-t-Test]. Maßstabsbalken: 50 μm. g Experimentelles Schema. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre wurde in den mPFC von Adrb1fl/fl- oder Adrb2fl/fl-Mäusen und ihren WT- und heterozygoten Wurfgeschwistern injiziert. Vier Wochen später wurde die SRM-Aufgabe durchgeführt. h Repräsentatives Bild der Cre-EGFP-Expression im mPFC. Maßstabsbalken: 500 μm. i, j Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte der Mäuse mit Adrb1- oder Adrb2-Knockout im mPFC. [i WT: n = 13, Adrb1fl/+: n = 10, Adrb1fl/fl: n = 11. F Maus × Genotyp (2, 31) = 4,085, p = 0,027, Zweiweg-RM-ANOVA; Rechts: F (2, 31) = 5,364, p = 0,01, einfaktorielle ANOVA. j WT: n = 15, Adrb2fl/+: n = 12, Adrb2fl/fl: n = 11. Links: F Maus × Genotyp (2, 35) = 4,433, p = 0,019, zweifaktorielle RM-ANOVA, rechts: F (2, 35) = 4,139, p = 0,024, einfache ANOVA]. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe.

Basierend auf den obigen Ergebnissen haben wir die Auswirkungen der nichtselektiven β-AR-Antagonisten Propranolol und Carvedilol auf die SRM-Konsolidierung getestet. Wenn Propranolol unmittelbar nach dem Geselligkeitstest beidseitig in den mPFC infundiert wurde, war die langfristige SRM erheblich beeinträchtigt (Abb. 3a – c), während die kurzfristige SRM intakt blieb (ergänzende Abb. 4a – c). Darüber hinaus beeinträchtigte die Propranolol-Infusion in den mPFC nach dem Training nicht die Gedächtniskonsolidierung der Angstkonditionierung (ergänzende Abbildung 5). Im Gegensatz zu den Wirkungen von Propranolol hatte Carvedilol, ein G-Protein-beeinflusster β-AR-Antagonist 28, 29, 30, keinen Einfluss auf die SRM-Konsolidierung (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass die SRM-Konsolidierung möglicherweise nicht vom G-Protein-Signalweg abhängt. Bei den SRM-Aufgaben zeigten alle Mäuse während des Geselligkeitstests eine signifikante Präferenz für die neuartige Maus gegenüber dem leeren Käfig (ergänzende Abbildung 4b, d). Diese Daten legen nahe, dass die β-AR-Aktivierung im mPFC selektiv an der SRM-Konsolidierung beteiligt ist und dass für diesen Gedächtnisprozess möglicherweise eine nicht-G-Protein-abhängige Signalübertragung erforderlich ist.

ein experimentelles Schema. Der β-AR-Antagonist Propranolol (10 μg) oder Carvedilol (5 μg) wurde direkt nach dem Training infundiert und SRM-Tests wurden einen Tag später durchgeführt. b Repräsentatives Bild der Kanülenimplantation im mPFC. Maßstabsbalken: 500 μm. c, d Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [c, Vehikel: n = 15, Propranolol: n = 13. Links: F-Maus × Behandlung (1, 26) = 6,906, p = 0,014, zweifaktorielle RM-ANOVA; Rechts: t (26) = 3,507, p = 0,002, zweiseitiger Student-t-Test. d Vehikel: n = 12, Carvedilol: n = 14. Links: F Maus × Behandlung (1, 24) = 2,707, p = 0,113, zweifaktorielle RM-ANOVA; Rechts: t (24) = −1,477, p = 0,153, zweiseitiger Student-t-Test]. e Repräsentatives Bild der Cre-EGFP-Expression im mPFC. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre wurde in den mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern injiziert. Maßstabsbalken: 100 μm. f Balkendiagramm für das relative Expressionsniveau der Arrb2-mRNA. 4 Wochen nach der Injektion von AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre in mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern [n = 7 für jede Gruppe, t (12) = 4,515, p < 0,001, zweiseitiger ungepaarter t-Test] . g Repräsentative Western Blots und Balkendiagramm für pERK-Spiegel im mPFC mit β-Arrestin2-Knockout [n = 5 für jede Gruppe. F Maus × Sitzung (1, 16) = 11,556, p = 0,004, Zwei-Wege-ANOVA]. h Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte. [WT: n = 12, Arrb2fl/fl: n = 15. Links: F Maus × Genotyp (1, 25) = 7,094, p = 0,013, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: t (25) = 2,557, p = 0,017, zweiseitiger ungepaarter t-Test]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ##p < 0,01 im Vergleich zur angegebenen Gruppe.

Wir schlagen vor, dass der β-Arrestin-Signalweg im mPFC an der SRM-Konsolidierung beteiligt sein könnte. Um diese Hypothese zu testen, injizierten wir AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre in den mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen und schalteten β-Arrestin2 in mPFC-erregenden Neuronen selektiv aus (Abb. 3e, f). Der selektive Knockout von β-Arrestin2 im mPFC verringerte die Präferenz für die neue Maus gegenüber der bekannten Maus signifikant, ohne die Geselligkeit, das Angstniveau oder die Bewegungsaktivität zu beeinflussen (Abb. 3h und ergänzende Abb. 6a – g), was darauf hindeutet, dass die β-Arrestin2-Expression in Der mPFC ist für die SRM-Konsolidierung erforderlich. β-Arrestine, die GPCRs nachgeschaltet sind, fungieren als Signalwandler und vermitteln die Aktivierung einer Vielzahl von Signalen und zellulären Reaktionen, einschließlich der ERK-Aktivierung30,31,32. Daher untersuchten wir die ERK-Aktivierung im mPFC von Wildtyp- (WT) und β-Arrestin2-Knockout-Mäusen nach dem Geselligkeitstest. Die Ergebnisse zeigten, dass der Geselligkeitstest die pERK-Spiegel im mPFC von WT-Wurfgeschwistern signifikant erhöhte, nicht jedoch bei β-Arrestin2-mPFC-Knockout-Mäusen (Abb. 3g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der β-Arrestin-vermittelte Signalweg eine entscheidende Rolle bei der SRM-Konsolidierung spielt.

Um zu bestätigen, dass die NEerge Konsolidierung von SRM durch β-ARs und einen β-Arrestin-abhängigen Signalweg im mPFC vermittelt wird, haben wir die SRM-Aufgabe mit β1-AR- und β-Arrestin2-mPFC-Knockout-Mäusen mit optischer Stimulation der LC-NE-Terminals im mPFC durchgeführt mPFC (Abb. 4a, b). Der selektive Knockout von β1-AR im mPFC beeinträchtigte die SRM-Konsolidierung, die durch optogenetische Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen nicht behoben werden konnte (Abb. 4c). Darüber hinaus wurde eine beeinträchtigte SRM-Konsolidierung aufgrund der selektiven Deletion von β-Arrestin2 im mPFC durch die Aktivierung von LC-mPFC-NE-Projektionen nicht wiederhergestellt (Abb. 4e). Darüber hinaus zeigten die WT-Mäuse mit aktivierten LC-mPFC-NE-Projektionen anhaltend höhere Präferenzen für die neue Maus als die Mäuse in der Kontrollgruppe, während die Mäuse mit der Deletion von β1-AR oder β-Arrestin2 im mPFC eine beeinträchtigte Diskriminierung zeigten neuartige Maus 4 Tage nach dem Training, auch mit Aktivierung von LC-mPFC NE-Projektionen (Abb. 4d, f).

ein experimentelles Schema. AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry und AAV9-THP-iCre wurden in den LC injiziert, AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre wurde in den mPFC injiziert und optische Fasern wurden über dem mPFC von Adrb1fl/fl oder Arrb2fl implantiert /fl Mäuse. Vier Wochen später wurde die SRM-Aufgabe durchgeführt. Zur Stimulation der NE-Terminals im mPFC wurde blaues Licht abgegeben (473 nm, zwanzig 5-ms-Impulse bei 25 Hz, alle 5 s, 5-minütige Dauer), nachdem einen Tag später der Geselligkeitstest und die SRM-Tests durchgeführt wurden. b Repräsentative Bilder der ChR2-mCherry-Expression im LC, der Cre-EGFP-Expression, der ChR2-mCherry+-Terminals und der Glasfaserspitze im mPFC. c–f Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [c, d mCherry/EGFP, n = 12; ChR2/EGFP, n = 11; ChR2/Cre, n = 13; mCherry/Cre, n = 12. c Links: F Maus × Virus (3, 44) = 7,961, p < 0,001, zweifache RM-ANOVA; Rechts: F (3, 44) = 4,139, p < 0,001, einfaktorielle ANOVA; d Links: F Maus × Virus (3, 44) = 5,895, p = 0,004, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: F (3, 44) = 8,928, p < 0,001, einfaktorielle ANOVA. e, f mCherry/EGFP, n = 12; ChR2/EGFP, n = 13; ChR2/Cre, n = 13; mCherry/Cre, n = 12. e Links: F Maus × Virus (3, 46) = 7,304, p < 0,001, zweifache RM-ANOVA; Rechts: F (3, 46) = 7,469, p < 0,001, einfaktorielle ANOVA; f Links: F Maus × Virus (3, 46) = 10,826, p < 0,001, zweifache RM-ANOVA; Rechts: F (3, 46) = 9,586, p < 0,001, einfaktorielle ANOVA]. g scAAV1-hSyn-FlpO wurde in den LC injiziert und AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry wurde in den mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen injiziert. Repräsentative Bilder der Cre-mCherry-Expression im mPFC. h Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [WT: n = 11; Arrb2fl/fl: n = 15. Links: F Maus × Virus (1, 24) = 4,7, p = 0,04, zweiseitige RM-ANOVA, rechts: t (24) = 2,196, p = 0,038, zweiseitige Student-T prüfen]. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe. Maßstabsbalken: 100 μm.

Studien zeigen, dass hohe AAV1-Titer eine anterograde transsynaptische Ausbreitung zeigen33. Injektionen des Cre/FlpO-Rekombinase-exprimierenden AAV1 in den Gehirnbereich, der präsynaptische Neuronen enthält, und gleichzeitige Injektionen von AAV mit einer Cre/FlpO-induzierbaren Expressionskassette in den stromabwärts gelegenen Bereich ermöglichen die selektive Markierung postsynaptischer Neuronen, die von der präsynaptischen Region innerviert werden34,35. Anschließend injizierten wir anterogrades scAAV1-hSyn-FlpO mit hohem Titer in den LC und AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry in den mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen, was die Expression von Cre-Rekombinase und anschließendes Knockout von β-Arrestin2 im mPFC ermöglichte Neuronen, die von den adrenergen und nicht adrenergen LC-Neuronen innerviert werden (Abb. 4g). Mäuse mit selektiver β-Arrestin2-Deletion zeigten eine verminderte Präferenz für die neue Maus, was darauf hindeutet, dass die β-Arrestin2-Expression im LC-mPFC-Kreislauf für die SRM-Konsolidierung erforderlich ist (Abb. 4h). Alle Mäuse zeigten eine intakte Geselligkeit (Ergänzende Abbildung 7). Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Regulierung der LC-mPFC-NE-Freisetzung während der SRM-Konsolidierung durch β-Arrestin-abhängige β-adrenerge Signale vermittelt wird.

Wir entwickelten einen Adeno-assoziierten Virusvektor und lieferten die R165L-Mutante rM3Dq (rM3Darr)36 an den mPFC, um die β-Arrestin-abhängige Signalübertragung durch CNO-Behandlung pharmakologisch zu aktivieren. Wir haben zunächst die Aktivierung der β-Arrestin-abhängigen Signalübertragung in mit rM3Darr transfizierten N2a-Zellen bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass CNO (1 μM) die pERK-Spiegel 15–30 Minuten nach der Behandlung signifikant erhöhte (Abb. 5a). Darüber hinaus inhibierte der Abbau von β-Arrestin2 die durch CNO-Behandlung (1 μM) induzierte ERK-Aktivierung in N2a-Zellen mit rM3Darr-Expression (Abb. 5b), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von rM3Darr eine β-Arrestin-abhängige ERK-Aktivierung induziert. Anschließend exprimierten wir rM3Darr-mCherry im mPFC und führten ein Dreikammer-SRM-Experiment durch (Abb. 5c, d). Die unmittelbar nach dem Geselligkeitstest mit CNO (1 mg/kg, ip) behandelten Mäuse zeigten während des einen Tag später durchgeführten SRM-Tests keine weitere erhöhte Präferenz für die neue Maus; Sie zeigten jedoch während des vier Tage später durchgeführten SRM-Tests eine anhaltende Präferenz für die neue Maus (Abb. 5e, f), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung des β-Arrestin2-Signals die SRM-Konsolidierung fördert. Als nächstes exprimierten wir rM3Darr-mCherry im mPFC und eNpHR3.0-EYFP in LC NE-Neuronen und implantierten optische Fasern im mPFC (Abb. 5g). Die optogenetische Hemmung der LC-mPFC-NE-Projektionen verringerte die Präferenz für die neue Maus, während die Aktivierung des β-Arrestin-Signalwegs die Präferenz für die neue Maus deutlich steigerte (Abb. 5h), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung des β-Arrestin-Signalwegs die beeinträchtigte soziale Funktion wiederherstellte Speicher, der durch die Hemmung von LC-mPFC-NE-Projektionen verursacht wird. Darüber hinaus haben wir gleichzeitig rM3Darr-mCherry exprimiert und β1-AR im mPFC gelöscht (Abb. 5i). Obwohl die SRM-Konsolidierung durch die Deletion von β1-AR im mPFC beeinträchtigt wurde, stellte die Aktivierung des β-Arrestin-Signalwegs das Gedächtnis für die bekannte Maus wieder her und erhöhte die Präferenz für die neue Maus (Abb. 5j). Alle Mäuse bevorzugten die neuartige Maus während des Geselligkeitstests gegenüber dem leeren Käfig (ergänzende Abbildung 8). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die SRM-Konsolidierung durch die pharmakologische Aktivierung der durch β-Arrestin beeinflussten Signalübertragung gefördert werden kann.

a CNO (1 μM) erhöhte die pERK-Spiegel 15–30 Minuten nach der Behandlung in mit rM3Darr transfizierten N2a-Zellen signifikant [n = 7 für jede Gruppe, 15 Minuten: F (5, 36) = 5,261, p < 0,001, einseitig ANOVA]. b Arrb2-Knockdown inhibierte die ERK-Aktivierung durch CNO-Behandlung (1 μM) in mit rM3Darr transfizierten N2a-Zellen nach 15 Minuten [n = 6 für jede Gruppe, F-shRNA × Behandlung (1, 20) = 8,207, p = 0,010, Zwei-Wege-ANOVA ]. c Experimentelles Schema. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry und AAV9-CAG-Cre wurden in den mPFC von C57BL/6 J-Mäusen injiziert. Vier Wochen später wurde die SRM-Aufgabe durchgeführt. Den Mäusen wurde nach dem Training CNO (1 mg/kg, ip) injiziert und SRM-Tests wurden 1 Tag und 4 Tage später durchgeführt. d Repräsentatives Bild des rM3Darr-mCherry-Ausdrucks im mPFC. e, f Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [Kochsalzlösung, n = 13; CNO, n = 15. e Links: F Maus × Behandlung (1, 26) = 2,29, p = 0,142, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: t (26) = −1,121, p = 0,273, zweiseitiger Student-t-Test. f Links: F Maus × Behandlung (1, 26) = 7,024, p = 0,014, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: t (26) = −2,579, p = 0,016, zweiseitiger Student-t-Test]. g Virusinjektion und repräsentative Bilder der eNpHR3.0-EYFP-Expression im LC, der rM3Darr-mCherry-Expression und der Glasfaserspitze im mPFC. AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP wurde in den LC injiziert, AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry und AAV9-CAG-Cre wurden in den mPFC von TH-Cre-Mäusen injiziert. Über dem mPFC wurden optische Fasern implantiert. h Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [EYFP/mCherry, n = 13; EYFP/rM3Darr, n = 12; eNpHR3.0/rM3Darr, n = 14; eNpHR3.0/mCherry, n = 13. Links: F Maus × Virus (3, 48) = 7,135, p < 0,001, Zwei-Wege-RM-ANOVA, Rechts: F (3, 48) = 8,697, p < 0,001, eins -Weg-ANOVA]. i Virusinjektion und repräsentatives Bild der rM3Darr-mCherry- und Cre-EGFP-Expression im mPFC. j Statistische Diagramme der Erkundungszeit und der Unterscheidungswerte [Kochsalzlösung, n = 12; CNO, n = 15. Links: F mous × Behandlung (1, 25) = 9,238, p = 0,005, zweifaktorielle RM-ANOVA; Rechts: t (25) = −3,638, p = 0,001, zweiseitiger Student-t-Test]. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 und ###p < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe. Maßstabsbalken: 100 μm.

Ein Rückgang des deklarativen Lernens und der Gedächtnisleistung ist ein häufiges Phänomen im Zusammenhang mit dem Alter37. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die SRM-Konsolidierung bei älteren Mäusen (> 18 Monate alt, Abb. 6a, b) beeinträchtigt ist. Daher exprimierten wir rM3Darr-mCherry im mPFC gealterter Mäuse (Abb. 6c). Die Daten zeigten, dass die Behandlung mit CNO (1 mg/kg, ip) nach dem Geselligkeitstest die Präferenz für die neue Maus im SRM-Test signifikant steigerte (Abb. 6d). Alle Mäuse bevorzugten die neuartige Maus während des Geselligkeitstests gegenüber dem leeren Käfig (ergänzende Abbildung 9). Diese Daten legen nahe, dass die durch β-AR/β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung ein potenzielles Medikamentenziel für die Verbesserung des sozialen Gedächtnisses bei älteren Menschen sein könnte.

ein experimentelles Schema. Die SRM-Aufgabe wurde an älteren Mäusen (> 18 Monate alt) durchgeführt. b Statistische Diagramme der Erkundungszeit und der Diskriminierungswerte [Junger Erwachsener, n = 12; Gealtert, n = 11. Links: F Maus × Alter (1, 21) = 9,816, p = 0,005, Zwei-Wege-RM-ANOVA; Rechts: Z = 33.000, p = 0,045, Mann-Whitney-U-Test]. c Repräsentatives Bild des rM3Darr-mCherry-Ausdrucks im mPFC. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry und AAV9-CAG-Cre wurden in den mPFC von gealterten Mäusen (> 18 Monate alt) injiziert. d Statistische Diagramme der Erkundungszeit für die bekannten (F) und neuartigen (N) Mäuse und Diskriminierungswerte [Kochsalzlösung, n = 11; CNO, n = 12. Links: F Maus × Behandlung (1, 21) = 4,979, p = 0,037, zweiseitige RM-ANOVA, rechts: t (21) = −2,95, p = 0,008, zweiseitiger Student-t-Test ]. e Arbeitsmodell, das veranschaulicht, dass LC-mPFC NE-Projektionen die Gedächtniskonsolidierung der sozialen Anerkennung durch β-Arrestin2-verzerrte Signalübertragung regulieren. *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 im Vergleich zur angegebenen Gruppe. Maßstabsbalken: 100 μm.

In dieser Studie fanden wir heraus, dass LC-mPFC-NE-Projektionen die SRM-Konsolidierung durch β-AR/β-Arrestin-abhängige Signale im mPFC kontrollierten (Abb. 6e). Die Aktivierung von LC-mPFC NE-Projektionen oder der β-Arrestin-Signalisierung förderte die Aufrechterhaltung des sozialen Gedächtnisses. Darüber hinaus wurde die Beeinträchtigung der SRM-Konsolidierung, die durch die Hemmung der NE-Projektion oder die Deletion von β1-AR im mPFC verursacht wurde, durch die Aktivierung der durch β-Arrestin beeinflussten Signalübertragung wiederhergestellt.

Die Drei-Kammer-Aufgabe ist ein weit verbreitetes Testparadigma zur quantitativen Messung der Geselligkeit und des sozialen Gedächtnisses38,39. Die Maus beschließt, eine der drei Kammern zu betreten; Daher kann die Geselligkeit gemessen werden, indem die Präferenz für eine neuartige Maus direkt mit der Präferenz für einen leeren Drahtkäfig verglichen wird. Mit dieser Aufgabe kann auch das soziale Wiedererkennungsgedächtnis bewertet werden, indem Interaktionen mit einer neuartigen Maus mit Interaktionen mit bekannten Mäusen in jeder Kammer verglichen werden. Es bleibt jedoch unklar, ob Mäuse soziale Neuheiten oder nur Neuheiten im Drahtkäfig bevorzugen. Möglicherweise interessiert es die Mäuse nur, dass der zuvor leere Käfig nun etwas oder eine neuartige Maus enthält.

Unsere Daten zeigten, dass die Injektion von Propranolol, einem β-adrenergen Antagonisten, oder das Ausschalten von β-AR im mPFC die SRM-Konsolidierung erheblich beeinträchtigte, während die Injektion von Carvedilol, einem nicht selektiven β-AR-G-Protein-abhängigen Antagonisten und α1-AR-Antagonisten, induziert wurde keine solche Beeinträchtigung. Die unterschiedlichen Wirkungen von Propranolol und Carvedilol legen nahe, dass β-AR, nicht jedoch α1-AR, im mPFC am Prozess der SRM-Konsolidierung beteiligt ist. Viele Studien haben gezeigt, dass α2-AR im mPFC am Arbeitsgedächtnis beteiligt ist, und kamen zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen. Einige Studien haben berichtet, dass die Aktivierung von α2-AR die mPFC-Funktionen beeinträchtigt, beispielsweise die Leistung des Arbeitsgedächtnisses37,40. Andere Studien haben jedoch berichtet, dass α2-adrenerge Agonisten die Funktionen des präfrontalen Kortex, einschließlich des Arbeitsgedächtnisses, verbessern41,42. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Verabreichung eines α2-adrenergen Antagonisten (der die NE-Konzentrationen erhöht) die soziale Anerkennung verbessert43. Aufgrund der unterschiedlichen Expression von α- und β-adrenergen Rezeptoren in Pyramidenneuronen und Interneuronen müssen die unterschiedlichen Rollen von α-AR und β-AR im mPFC bei der Konsolidierung des Gedächtnisses für soziale Anerkennung weiter untersucht werden.

Bei der Ligandenbindung unterliegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), einschließlich β-ARs, Konformationsänderungen, die ihre Bindung an heterotrimere G-Proteine ​​und β-Arrestine fördern. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass sowohl heterotrimere G-Proteine ​​als auch β-Arrestine in der Lage sind, unabhängig voneinander mit intrazellulären Signalmolekülen zu interagieren und diese zu rekrutieren44,45. Die meisten Liganden, die an GPCRs binden, weisen eine ausgewogene oder unvoreingenommene Signalaktivität durch G-Proteine ​​und β-Arrestine auf. Es wurden auch einige Liganden entdeckt, die einen Weg gegenüber den anderen bevorzugen. Carvedilol ist ein G-Protein-abhängiger β-AR-Antagonist, der die β-Arrestin-Signalübertragung leicht aktiviert. Propranolol ist ein vollständiger Antagonist, der sowohl den G-Protein- als auch den β-Arrestin-Weg blockiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass Carvedilol selektiv die Rekrutierung von Gαi für β1-AR fördert, den β-Arrestin2-gesteuerten Weg aktiviert28, 46 und die β1-AR-vermittelte Transaktivierung des EGFR und die β-Arrestin2-abhängige ERK-Aktivierung induziert30, was darauf hindeutet, dass β -Arrestin2 kann die β1-AR-Signalübertragung unabhängig vermitteln. Es wird seit langem angenommen, dass der herkömmliche G-Protein/cAMP/PKA-Signalweg die Rolle von β-ARs im Gedächtnis vermittelt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Blockierung der β-AR-Übertragung mit Propranolol die Gedächtniskonsolidierung oder -rekonsolidierung während der Angstkonditionierung, Objekterkennung und kokaininduzierten CPP beeinträchtigt42,47,48. Die Hemmung der Aktivitäten bestimmter Komponenten von G-Protein-gekoppelten Signalwegen, wie PKA und CREB, stört die Gedächtniskonsolidierung und -rekonsolidierung49,50. Die Wiederherstellung des Gedächtnisses erfordert jedoch eine Proteinsynthese, jedoch keine PKA-Aktivierung51. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die durch β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung im entorhinalen Kortex die Wiederherstellung des Objekterkennungsgedächtnisses vermittelt22, was darauf hindeutet, dass der β-Arrestin-abhängige Signalweg eine Rolle bei der Gedächtnisspeicherung spielen sollte. In dieser Studie unterdrückte Carvedilol SRM im Gedächtnistest 1 nicht, während Propranolol dies tat, was darauf hindeutet, dass die SRM-Konsolidierung nach dem Training möglicherweise nicht von einem G-Protein-beeinflussten Signalweg abhängt. Darüber hinaus zeigten Mäuse mit β-Arrestin-2-Knockout im mPFC eine beeinträchtigte SRM-Konsolidierung. Wenn der β-Arrestin-Signalweg nach dem Training aktiviert wurde, wurde die SRM-Aufrechterhaltung gefördert und die beeinträchtigte SRM-Konsolidierung, die durch die Hemmung von LC-mPFC-Projektionen oder die β1-AR-Deletion verursacht wurde, behoben. Daher schlagen wir vor, dass die Regulierung von LC-mPFC-NE-Projektionen die SRM-Konsolidierung durch β-Arrestin-abhängige Signalwege im mPFC regulieren könnte.

Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass ältere Tiere bei sozialen Aufgaben ein deutlich verringertes Interaktionsniveau mit neuen Jungmäusen zeigen, selbst wenn kein offenkundiger kognitiver Rückgang vorliegt52,53, was darauf hindeutet, dass soziale Schaltkreise während des Alterns besonders anfällig sind. Es wird seit langem berichtet, dass LC-Neuronen bei älteren Menschen54 und Tieren deutlich reduziert sind als bei jungen Individuen55, was zu Problemen im sozialen Gedächtnis bei älteren Mäusen beitragen könnte. In dieser Studie fanden wir heraus, dass die direkte Aktivierung der β-Arrestin-Signalübertragung durch Stimulierung von rM3Darr-exprimierenden Neuronen im mPFC die bevorzugte Exploration bei älteren Mäusen signifikant steigerte. Somit zeigt unsere Studie, dass die durch β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung für die SRM-Speicherung von entscheidender Bedeutung ist.

Das Konzept der Ligandenverzerrung bei der GPCR-Downstream-Signalisierung hat in letzter Zeit zunehmende Aufmerksamkeit erlangt. Mehrere voreingenommene Liganden haben klinisches Potenzial, darunter β-Arrestin-voreingenommene Liganden des Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptors (AT1R)56, G-Protein-voreingenommene Liganden des μ-Opioidrezeptors (MOR)57 und β-Arrestin-voreingenommene Liganden des Dopamin-D2-Rezeptors58. Allerdings ist die Zahl der in der Literatur beschriebenen voreingenommenen Liganden noch begrenzt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die β-AR/β-Arrestin-gesteuerte Signalübertragung für die SRM-Speicherung von entscheidender Bedeutung ist, was das Potenzial für die Entwicklung neuer β-AR-Agonisten mit spezifischer β-Arrestin-gesteuerter Aktivierung zur Gedächtnisverbesserung zeigt.

Unsere Studie legt nahe, dass LC-mPFC NE-Projektionen die Gedächtniskonsolidierung bei sozialer Anerkennung über die β-AR/β-Arrestin-abhängigen Signalwege regulieren und damit Belege für die neurobiologischen Funktionen des β-Arrestin-abhängigen Signalwegs bei der Gedächtnisspeicherung liefern. Diese Daten deuten darauf hin, dass β-Arrestin-abhängige β-adrenerge Liganden ein potenzielles Medikamentenziel zur Verbesserung der Gedächtnisspeicherung und zur Behandlung psychischer Erkrankungen sein könnten.

Die transgenen männlichen Mäuse Adrb1fl/fl und Adrb2fl/fl wurden von unserem Labor entwickelt und mehr als zehnmal mit dem Stamm C57BL/6J rückgekreuzt (Adrb1: ENSMUSE000000000294435; Adrb2: ENSMUSE00000399288). Arrb2fl/fl wurden freundlicherweise von Professor Pei Gang (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften) zur Verfügung gestellt. TH-Cre-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft (Bestellnummer: 008601). Fünf Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Shanghai Laboratory Animal Center, CAS, gekauft. Alle Mäuse wurden in Gruppen mit 3–4 Mäusen pro Käfig unter einem 12-stündigen Licht-Dunkel-Zyklus (20:00–8:00 Uhr Licht an) mit Zugang zu Wasser und Futter nach Belieben gehalten. Es wurden erwachsene Mäuse (8–10 Wochen alt) und ältere Mäuse (>18 Monate) verwendet. Alle Verhaltenstests wurden während der Light-Off-Phase durchgeführt. Alle Tierbehandlungen entsprachen strikt dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und wurden vom Animal Care and Use Committee des Shanghai Medical College der Fudan University genehmigt. Die Nachkommen wurden unter Verwendung der folgenden Primersätze genotypisiert: 5'-CTGTTCGCATCGGAATGAAGC-3'; 5'-TGACGTCATGAACTGGGATTTCAG-3' (Adrb1fl/fl-Mäuse); 5′-TTGCCGCAGTCTGAAGAAGC-3′; 5′-AGGAAGGATTGTCTCCCAGTATGAC-3′ (Arrb2fl/fl-Mäuse); 5'-GGTTGCACAGCAGCCCTAGAT-3'; 5'-CCGTTATGTGCACCAGACTTTAGG-3' (Adrb2fl/fl-Mäuse); 5'-GAGACAGAACTCGGGACCAC-3'; 5'-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3' (TH-Cre-Mäuse). Alle Verhaltenssubjekte wurden individuell für mindestens 3 Tage an den Experimentator gewöhnt.

Propranolol [(+/−)-Propranolol HCl] (Sigma-Aldrich, Nr. P0884-1G) wurde in Kochsalzlösung gelöst. Carvedilol (Tocris Bioscience, Nr. 2685) wurde in Kochsalzlösung mit 1 % Dimethylsulfoxid gelöst. Propranolol (10 μg) oder Carvedilol (5 μg) wurden bilateral in den mPFC infundiert. Clozapin-N-oxid [CNO] (Sigma-Aldrich, Nr. C0832-5MG) wurde in Kochsalzlösung gelöst. Den Mäusen wurde CNO (1 mg/kg, ip) intraperitoneal injiziert.

Der pcDNA3.1-Vektor mit rM3Darr wurde von Professor Ken-ichiro Nakajima bereitgestellt, der dieses Konstrukt erstellte, das M3 mit der Punktmutation R165L enthielt. AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry wurde entwickelt, um selektiv die durch β-Arrestin beeinflusste Signalübertragung zu aktivieren, ohne die G-Protein-vermittelten Signalwege als Reaktion auf die CNO-Behandlung zu stören, wie zuvor beschrieben36. Die Cre-Sequenz von pCAG-Cre-GFP (Addgene Plasmid # 13776) wurde über die Restriktionsenzymstellen ECOR I und Sal I in pAAV2-THP-EGFP (Addgene Plasmid # 80336) kloniert. AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre, AAV9-mCaMKIIα-EGFP, AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato, AAV9-THP-Cre, scAAV1-hSyn-FlpO und AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry wurden verpackt von Taitool Biological Co., Ltd. NE2h-EGFP und AAV9-CAG-Cre wurden von Neuron Biotech Co., Ltd. verpackt. AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry und AAV9-EF1α-DIO-mCherry wurden von BrainVTA Co., Ltd. verpackt. In allen Experimenten wurden AAV-Titer im Bereich von 2,0 × 1012 bis 2,5 × 1012 Vektorgenom (vg) ml-1 verwendet. Für eine anterograde Infektion wurde ein hoher Titer an scAAV1-hSyn-FlpO (1 × 1013 Vektorgenom (vg) ml−1) angewendet.

Die Mäuse wurden mit Isofluran (3,5 % Einleitung, 1,5–2 % Erhaltung) anästhesiert und in einen stereotaktischen Apparat (Stoelting Instruments, USA) gegeben. Das Virus wurde im mPFC (von Bregma: anterior-posterior (AP), + 1,8 mm; mediolateral (ML), ± 0,30 mm; und dorsal-ventral (DV), −2,5 mm) oder im LC (AP, –5,4 mm; ML, ± 0,85 mm und DV, –4,0 mm). Das Virus wurde mit einer 10-μl-Spritze und einer stumpfen 36-Gauge-Nadel unter der Steuerung einer UMP3-Ultramikropumpe (World Precision Instruments, USA) mit kontrolliertem Volumen und kontrollierter Flussrate (150 nl bei 50 nl/min) abgegeben. Nach der Injektion wurde die Nadel weitere 10 Minuten lang belassen und dann langsam entfernt. Die optischen Fasern (0,37 NA, 200 μm Kerndurchmesser; Anilab) wurden über dem mPFC implantiert (AP, +1,9 mm; ML, ±1,1 mm; und DV, –2,4 mm, 20°-Winkel). Nach der Operation durften sich die Mäuse mindestens drei Wochen lang erholen, bevor Verhaltensexperimente durchgeführt wurden.

Mäuse wurden mit Isofluran (3,5 % Einleitung, 1,5–2 % Erhaltung) anästhesiert und in einen stereotaktischen Apparat gegeben. Die Medikamentensockel-Führungskanülen (27 Gauge, RWD Life Science Co. Ltd.) wurden bilateral 1 mm über dem mPFC implantiert (AP, +1,9 mm; ML, ±1,1 mm; und DV, –1,4 mm, 20°-Winkel). Vor den Verhaltenstests durften sich die Tiere mindestens zwei Wochen lang von der Operation erholen. Eine 34-Gauge-Stahlnadel mit einem Vorsprung von 1,0 mm wurde an eine Infusionspumpe (BAS Bioanalytical Systems Inc.) angeschlossen. Propranolol (10 μg), Carvedilol (5 μg) oder Kochsalzlösung wurden nach einem 3-Kammer-Geselligkeitstest oder einer Angstkonditionierung beidseitig über die Führungskanüle infundiert.

Die Tiere wurden transkardial mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (PB) perfundiert und anschließend weitere 4 Stunden nachfixiert. Die Gehirne wurden mindestens 48 Stunden lang mit 30 % (Gew./Vol.) Saccharose/Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) kryogeschützt und die Schnitte wurden mit einem Vibratom (CM3050S, Leica) bei 30 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit 10 % normalem Ziegenserum in PBS mit 0,3 % Triton 600-401-379) oder GFP61 (Huhn, 1:500; Thermo Fisher Scientific, A-10262), in PBST bei 4 °C über Nacht. Die Schnitte wurden dreimal jeweils 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) mit PBS gespült, gefolgt von der Inkubation des sekundären Antikörpers [Alexa-488 oder Cy3 IgG (Maus, Kaninchen oder Huhn, 1:50.000, Jackson ImmunoResearch)] in PBST RT für 2 Stunden. Anschließend wurden die Schnitte dreimal jeweils 15 Minuten lang mit PBS gespült und dann auf Objektträger montiert. Die Bilder wurden mit einer konfokalen Nikon A1 mit Objektiven ×10 oder ×20 betrachtet und fotografiert.

Die Sozialverhaltensaufgabe wurde in einem Dreikammerapparat, einer rechteckigen, nicht transparenten Plexiglasbox (40 cm Länge × 63 cm Breite × 23 cm Höhe), durchgeführt. Die Box war durch zwei Plexiglaswände mit einer kleinen runden Tür (7 cm Durchmesser) unterteilt. Zwei Außenkammern (40 cm Länge × 21 cm Breite × 23 cm Höhe) waren durch eine Mittelkammer (40 cm Länge × 21 cm Breite × 23 cm Höhe) verbunden. Der SRM-Test wurde nach der Gewöhnungssitzung und dem Geselligkeitstest10 durchgeführt.

Die Versuchsmaus wurde in der mittleren Kammer freigelassen und durfte die Dreikammerbox mit einem leeren Drahtbehälter in jeder äußeren Kammer für 10 Minuten an drei aufeinanderfolgenden Tagen erkunden.

Am vierten Tag wurde eine junge männliche Maus (neuartige Maus, 3–5 Wochen alt), die zuvor keinen Kontakt mit der Versuchsmaus hatte, in einen Drahtkäfig in einer Kammer eingeführt, die als „soziales“ Fach bezeichnet wurde. In der anderen Kammer wurde unterdessen ein identischer, leer gebliebener Drahtkäfig aufgestellt. Die Versuchsmaus wurde in der mittleren Kammer freigelassen und durfte die drei Kammern für zwei 10-minütige Versuche erkunden, wobei zwischen den Versuchen ein Abstand von 15 Minuten lag. Gezählt wurde die Zeit, die Mäuse innerhalb eines 2-cm-Radius in der Nähe jedes Drahtkäfigs verbrachten (Annäherung, Stehen, schnüffelndes Aufsteigen und Kontaktzeit von Nase zu Nase).

SRM-Tests wurden 1 Stunde, 1 Tag oder 4 Tage nach den Geselligkeitstests durchgeführt, und die Versuchsmaus wurde 10 Minuten lang in der mittleren Kammer freigelassen. Während des Gedächtniserhaltungstests enthielt eine Kammer einen Drahtkäfig mit einer jungen, fremden männlichen Maus (neuartige Maus, 3–5 Wochen alt) und die andere Kammer enthielt einen Drahtkäfig mit der bekannten Maus, die zuvor im Geselligkeitstest exponiert worden war (vertraute Maus). Somit ist die bekannte Maus dieselbe, die im Geselligkeitstest verwendet wird, und die neuartige Maus unterscheidet sich in jedem SRM-Test. Auch hier wurde die Position der neuartigen Maus und der bekannten Maus zwischen den Sitzungen ausgeglichen. Der Drahtkäfig wurde vor und zwischen den Versuchen gründlich gereinigt. Alle Sitzungen wurden mit einer digitalen Videokamera aufgezeichnet. Die Zeit, die die Mäuse während jeder Sitzung mit den bekannten und neuartigen Mäusen verbrachten, wurde mit der Ethovision XT-Software (Noldus, Wageningen, Niederlande) analysiert.

Die Bewertung der Geselligkeitsdiskriminierung (Gleichung 1) wurde wie folgt berechnet:

Der Diskriminierungswert im sozialen Gedächtnis (Gleichung 2) wurde wie folgt berechnet:

Die optogenetische Stimulation erfolgte unmittelbar nach dem Geselligkeitstest (3–4 Wochen nach Virusinfusion und Glasfaserimplantation). Die optischen Fasern wurden über ein Patchkabel mit einem Paar FC/PC-Anschlüssen und einer 1 × 2-Faser an einen 473-nm- (blaues Licht) oder 590-nm-Laser (gelbes Licht) (Shanghai Dream Lasers Technology Co. Ltd.) angeschlossen Drehgelenk. Zur Stimulation von ChR2 wurde blaues Licht mit 5 mW mit zwanzig 5-ms-Impulsen bei 25 Hz alle 5 s für die Dauer von 5 Minuten abgegeben. Zur Stimulation von eNpHR3.0 wurde 10 Minuten lang konstant gelbes Licht mit 10 mW abgegeben. Die Laserlichtabgabe durch die optischen Fasern wurde durch eine digitale Leistungsmesserkonsole eingestellt und mit einem Master 8-Impulsstimulator (AMPI) moduliert.

AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato oder AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP und AAV9-hSyn-NE2h-EGFP-Virus wurden einzeln in den LC und den mPFC injiziert. Eine optische Faser (200 μm Durchmesser, 0,48 numerische Apertur (NA), Hangzhou Newdoon Technology) wurde einseitig in den mPFC implantiert. Photometrische Aufzeichnungen wurden nach der Virusinfusion und der Glasfaserimplantation 3–4 Wochen lang durchgeführt. Zur optogenetischen Photostimulation wurden die optischen Fasern über ein Patchkabel mit einem 590-nm-Laser (gelbes Licht) (Thinker Tech Nanjing Biotech) verbunden. Zur Stimulation der ChrimsonR+ NE-Terminals im mPFC wurde alle 15 s über 15–20 Versuche eine optische Stimulation (590 nm, 5 mW, 5 ms Impulse bei 5, 25 und 50 Hz, 1 s Dauer) über eine Glasfaser abgegeben im mPFC implantiert. Zur Stimulation der eNpHR3.0-Terminals im mPFC wurde alle 15 s über 15–20 Versuche eine optische Stimulation (590 nm, 10 mW, 10 s Dauer) über eine im mPFC implantierte optische Faser verabreicht. Gleichzeitig wurde die Fluoreszenzdynamik des NE-Sensors NE2h62 über dieselbe optische Faser aufgezeichnet, die im mPFC implantiert war. Die Faserphotometrie wurde ähnlich wie zuvor durchgeführt. Kurz gesagt, der NE-Sensor wurde mit zwei Anregungsquellen angeregt, die LED-Licht mit einer Wellenlänge von 470 nm und einer Wellenlänge von 405 nm entsprachen. Das Licht gelangte durch Anregungsfilter auf ein Glasfaser-Patchkabel, das mit der chronisch implantierten Faser verbunden war. Die Lichtintensität an der Spitze des Patchkabels betrug etwa 0,25 mW. Das Emissionslicht des NE-Sensors wanderte durch dieselben Fasern zurück zu einem Fotoempfänger. Die analogen Spannungssignale wurden mit 100 Hz digitalisiert und mit der Software Fiber Photometry (Thinker Tech Nanjing Biotech) aufgezeichnet. Die Daten wurden basierend auf optischen Stimulationsereignissen innerhalb einzelner Versuche segmentiert. Als Basis dienten die Z-Scores der 2-s vor der Stimulation. Photometriedaten wurden mit benutzerdefinierten MATLAB-Codes (MATLAB R2019a, MathWorks) analysiert.

Zur Angstkonditionierung wurden die Mäuse 3 Minuten lang in die Konditionierungskammer (Med Associates) gebracht. Einen Tag später wurden die Mäuse wieder in die Kammer gebracht und erhielten drei Ton-Fußschock-Paare (Ton: 2800 Hz, 85 dB, 30 s; FS: 0,5 mA, 1 s) im Abstand von 2 Minuten. Vierundzwanzig Stunden später wurde ein kontextueller Angstgedächtnistest durchgeführt und die Mäuse wurden der Konditionierungskammer drei Minuten lang ohne Ton ausgesetzt. Bei einer weiteren Kohorte von Mäusen wurde ein Cue-Fear-Gedächtnistest mit drei Tonversuchen (2800 Hz, 85 dB, 30 s) in 30-Sekunden-Intervallen in einem neuartigen Kontext durchgeführt. Der Prozentsatz der Gefrierzeit wurde automatisch von einem Computerprogramm (Med Associates) analysiert.

Der OF-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Bewertung der Bewegungsaktivität und des angeborenen Angstniveaus von Nagetieren. Zwei Tage vor den Tests durften sich die Mäuse an die Umgebung gewöhnen, in der der OF-Test durchgeführt wurde. Die Bewegungsaktivität wurde 30 Minuten lang in einer offenen Feldarena (40 × 40 cm) bei einer Leuchtdichte von 25 Lux gemessen. Das Gerät wurde vor und zwischen den Versuchen gereinigt. Gesamtstrecke, Distanz und Dauer im Mittelbereich wurden mit einem automatisierten Erkennungssystem (TopScan, CleverSys. lnc.) analysiert.

Die L/D-Box (46 × 27 × 30 cm) bestand aus Plexiglas und bestand aus zwei Fächern. Der größere Teil war das helle Fach (zwei Drittel der Schachtel) und der kleinere Teil war das dunkle Fach (ein Drittel der Schachtel). Der Test wurde mit 25 Lux Leuchtdichte im Leuchtkasten durchgeführt. Die Mäuse wurden mit dem Rücken zum Eingang aus der Mitte des Leuchtkastens entlassen und durften den Apparat 6 Minuten lang erkunden. Die L/D-Box wurde vor und zwischen den Versuchen gereinigt. Die im Dunkelabteil verbrachte Zeit wurde mithilfe eines automatisierten Erkennungssystems (TopScan, CleverSys. lnc.) analysiert.

Das erhöhte O-Labyrinth bestand aus zwei offenen Armen und zwei geschlossenen Armen mit seitlichen Wänden. Die Höhe des O-Labyrinths betrug 100 cm über dem Boden. Die Mäuse wurden in die Mitte des offenen Arms gelegt und durften 6 Minuten lang die Umgebung erkunden. Das O-Labyrinth wurde vor und zwischen jedem Trail gereinigt. Die in jedem Arm verbrachte Zeit wurde mit der Clever System-Software (TopScan, CleverSys. lnc.) analysiert.

Den Mäusen wurde zunächst intrakardial Kochsalzlösung und dann 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4-Puffer (pH = 7,5) perfundiert, und die Gehirne wurden entnommen. Nach 4-stündiger Nachfixierung in 4 % Paraformaldehyd wurden die Proben 3 Tage in 30 % Saccharose/PBS gelagert. FISH wurde an den fixierten gefrorenen Hirnschnitten mit einer Dicke von 10 μm gemäß den RNAscope-Verfahren (Advanced Cell Diagnostics, Inc., Newark, CA, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, gefrorene Schnitte (10 µm dick) wurden koronal durch die mPFC-Formation geschnitten. Die Schnitte wurden auf Superfrost Plus-Objektträger (Fisher Scientific, Waltham, USA) aufgetaut und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur für den Proteaseverdau vorbehandelt. Die Schnitte wurden dann mit Sonden von Maus-Adrb1 und Adrb2 (Adrb1, Zugangsnummer: NM_007419.2, Zielregion 158–1830; Adrb2, Zugangsnummer: NM_007420.3, Zielregion 55–962) 2 Stunden lang bei 40 °C mit inkubiert markierte Sondenmischung pro Objektträger. Die unspezifisch hybridisierte Sonde wurde durch Waschen der Schnitte in 1× Waschpuffer bei Raumtemperatur, gefolgt von 30-minütigem Waschen mit Verstärker 1-FL, 30-minütigem Verstärker 2-FL und 15-minütigem Verstärker 3-FL bei 40 °C entfernt. Jeder Verstärker wurde durch 2-minütiges Waschen mit 1 × Waschpuffer bei Raumtemperatur entfernt. Die Objektträger wurden mit einem LSM 510-Mikroskop (Zeiss) betrachtet, analysiert und fotografiert.

Das AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre-Virus wurde in den mPFC von Arrb2fl/fl-Mäusen und ihren WT-Wurfgeschwistern injiziert. Vier Wochen später wurde der mPFC sofort mit Maxtrix für Mäuse (Plastic One Inc.) auf Eis präpariert. Die Gesamt-RNA wurde aus mPFC von Arrb2fl/fl- und WT-Mäusen unter Verwendung des TRIzol®-Reagenzes (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA) extrahiert. Die reverse Transkription mit Zufallsprimern wurde gemäß dem Hiscript QRT SuperMix-System (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) in einem Zyklusprogramm bestehend aus 2 Minuten bei 42 °C, 15 Minuten bei 50 °C und 2 Minuten bei 85 °C durchgeführt . Die quantitative PCR wurde dreifach mit ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) mit einem Echtzeit-PCR-Thermocycler (Eppendorf realplex2 Mastercycler ep realplex, Deutschland) durchgeführt. Die Primer für CKO Arrb2-mRNA wurden so gestaltet, dass sie Exon 2 flankieren (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAA-3' und 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3'). Die Primer für WT Arrb2-mRNA wurden innerhalb von Exon 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAA-3' und 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3') entworfen. Die Primer für GAPDH sind 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' und 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'.

Maus-Neuroblastomzellen (N2a) wurden freundlicherweise von Professor Pei Gang (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften) zur Verfügung gestellt. N2a-Zellen wurden mit 20.000 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 12 Vertiefungen ausplattiert. Nach 20 Stunden wurden die Zellen vorübergehend mit AAV-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry/CAG-cre und β-Arrestin2-shRNA mit Lipofectamine 2000-Transfektionsreagenz (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) transfiziert. Etwa 48 Stunden später wurden die Zellen vor der CNO-Stimulation (1 μM) über Nacht in serumfreiem Medium inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Ripa-Lysepuffer (Beyotime, Nr. P0013B) auf Eis geerntet.

Die Versuchsmäuse wurden 3 Tage lang in Gruppen mit Jungmäusen gehalten. Während der Geselligkeitstests wurden die Mäuse mit einer bekannten oder einer neuartigen Maus in die Dreikammer mit einem Drahtkäfig gebracht. Zur Kontrolle der Geselligkeitstests wurden die Mäuse mit oder ohne optische Stimulation im heimischen Käfig gehalten. Die Mäuse wurden 15 Minuten nach dem Geselligkeitstest mit oder ohne optische Stimulation getötet. Eine Standard-Dreikammer-SRM-Aufgabe wurde in einer anderen Kohorte von Mäusen durchgeführt, die 15 Minuten nach dem Geselligkeitstest und anschließender Laserstimulation getötet wurden. Die Gehirne wurden sofort entfernt und Gewebeproben aus den mPFC- oder Zellproteinproben wurden mit Lysepuffer, der 1,0 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (Beyotime, Nr. P0013B) enthielt, homogenisiert, 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und 15 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert 4 °C. Die Proteinkonzentration wurde durch BCA-Assay (Thermo Fisher Scientific, Nr. 23227) bestimmt. Jede Probe wurde auf eine endgültige Proteinkonzentration von 2 μg/μl eingestellt, mit 6 × SDS-Ladepuffer (Beyotime, #P0015F) gemischt und 10 Minuten lang bei 95 °C gekocht. Die Proben wurden auf eine 10 %ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) geladen. Proteine ​​wurden elektrophoretisch von Gelen auf Nitrozellulose (NC)-Membranen (Whatman) übertragen, die dann mit den folgenden Primärantikörpern inkubiert wurden: Anti-pERK63 (1:1000 Verdünnung, Nr. 9101 S, Cell Signaling Technology), Anti-ERK63 (1:2000). , #4696 S, Cell Signaling Technology) bei 4 °C über Nacht. Die Membranen wurden dreimal 15 Minuten lang in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) gespült und dann mit IRDye 700DX oder 800DX-konjugiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) (1:50.000; Rockland Immunochemicals Inc.) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Proteinbanden wurden mit Odyssey (LI-COR Biosciences) sichtbar gemacht. Die Immunoblots wurden mit der Image J-Software analysiert. Der ERK-Phosphorylierungsgrad wurde berechnet, indem die Intensität von pERK auf die gesamte ERK-Expression normalisiert wurde.

Die experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mit GraphPad Prism aufgezeichnet. Daten aus Verhaltenstests wurden mit einem zweiseitigen Student-t-Test, einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) oder einer zweifaktoriellen ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Bonferronis Post-hoc-Test mit Sitzungen als Faktor innerhalb der Probanden und AAV als Faktor, analysiert Zwischensubjektfaktor. Die Photometrieaufzeichnung wurde mit einem zweiseitigen Student-t-Test oder einer einfaktoriellen ANOVA auf Fluoreszenztransienten analysiert. Die Immunfluoreszenzdaten wurden mit dem zweiseitigen Student-t-Test analysiert. Western-Blot-Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA analysiert. Die nicht normalisierten Daten wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test und der einfaktoriellen Kruskal-Wallis-ANOVA auf Rängen analysiert. Vollständige statistische Analysen zu jedem Datensatz sind in den Zusatzdaten 1 dargestellt. Alle Experimente wurden unabhängig voneinander an 4–15 Mäusen wiederholt, wie in der Abbildung dargestellt. Wenn möglich, wurden die Daten mithilfe biologischer Replikate gesammelt (Mehrhirnschnitte pro Tier, analysiert für In-situ-Hybridisierungsexperimente). Unsere Stichprobengrößen wurden auf der Grundlage früherer Erfahrungen geschätzt und ähneln denen, die allgemein in diesem Bereich verwendet werden.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder im Ergänzungsmaterial enthalten. Ergänzende Abbildung 10 enthält unbeschnittene Versionen aller Blots in der Arbeit. Ergänzende Daten 2 enthalten Quelldatenwerte, die den Abbildungen zugrunde liegen. 1d, f, j, l, n, o, 2c, f, i–j, 3c–d, f–h, 4c–f, h, 5a, b, e–f, h, j und 6b, d .

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Wir danken Dr. Gang Pei (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences) für Arrb2fl/fl-Mäuse und Dr. Ken-ichiro Nakajima für das R165L-Mutanten-M3-Konstrukt. Diese Forschung wurde vom Science Technology Innovation 2030 Project of China (2021ZD0203500 an FW und LM, 2021ZD0202104 an XL), den National Natural Science Foundation of China Grants (32171041 an XL, 31930046 an LM, 82021002 an LM) und dem CAMS Innovation Fund unterstützt für medizinische Wissenschaften (2021-I2M-5-009 an LM und XL), das Shanghai Municipal Science and Technology Major Project (2018SHZDZX01 an LM), ZJ Lab und Shanghai Center for Brain Science and Brain-Inspired Technology sowie die Chinese Postdoctoral Science Foundation (2021M690684 bis DC).

School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Institute of Brain Science, Abteilung für Neurologie, Pharmacology Research Center, Huashan Hospital, Fudan University, 200032, Shanghai, China

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma und Xing Liu

Forschungseinheit für Suchtgedächtnis, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften (2021RU009), 200032, Shanghai, China

Deqin Cheng, Junwen Wu, Enhui Yan, Xiaocen Fan, Feifei Wang, Lan Ma und Xing Liu

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DC, XL und LM planten die Experimente. DC und JW führten die Verhaltenstests durch. DC und EY führten die stereotaktischen chirurgischen und biochemischen Experimente durch. DC trug zu den Zellkultur- und Western-Blot-Experimenten bei. XF führte den FISH-Assay durch. DC, EY, JW und FW analysierten die Daten. DC und XL haben das Manuskript verfasst. XL und LM überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Lan Ma oder Xing Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Felix Leroy, Steven (A) Thomas und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Christian Wozny und George Inglis. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Cheng, D., Wu, J., Yan, E. et al. Die noradrenerge Konsolidierung des sozialen Erinnerungsgedächtnisses wird durch β-Arrestin-verzerrte Signale im präfrontalen Kortex der Maus vermittelt. Commun Biol 5, 1097 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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Eingegangen: 14. März 2022

Angenommen: 28. September 2022

Veröffentlicht: 17. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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