Optogenetische und pharmakologische Interventionen verbinden Hypocretin-Neuronen mit der Impulsivität bei Mäusen

Jun 30, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 74 (2023) Diesen Artikel zitieren

Neuronen im lateralen Hypothalamus, die das Neuropeptid Hypocretin, auch bekannt als Orexin, exprimieren, sind bekannte kritische Modulatoren der Erregungsstabilität. Ihre Rolle in den verschiedenen Komponenten des Erregungskonstrukts wie Aufmerksamkeit und Entscheidungsfindung ist jedoch kaum verstanden. Hier untersuchen wir die Dynamik neuronaler Hypocretin-Schaltkreise während der Stop-Action-Impulsivität in einer Go/NoGo-Aufgabe bei Mäusen. Wir zeigen, dass die neuronale Aktivität von Hypocretin mit der Erwartung einer Belohnung korreliert. Anschließend untersuchten wir die kausale Rolle der neuronalen Aktivität von Hypocretin mithilfe der Optogenetik in einer Go/NoGo-Aufgabe. Wir zeigen, dass die Stimulation von Hypocretin-Neuronen während der Cue-Periode die Anzahl vorzeitiger Reaktionen dramatisch erhöht. Diese Effekte werden durch Amphetamin nachgeahmt, durch Atomoxetin, einen Noradrenalin-Aufnahmehemmer, reduziert und durch einen selektiven Hypocretin-Rezeptor-1-Antagonisten blockiert. Wir kommen zu dem Schluss, dass Hypocretin-Neuronen eine Schlüsselrolle bei der Integration hervorstechender Reize im Wachzustand spielen, um angemessene und zeitnahe Reaktionen auf belohnende und aversive Signale hervorzurufen.

Die Hypocretine (Hcrts), auch Orexine genannt, sind zwei Neuropeptide, die vom gleichen Vorläufer abgeleitet sind1,2. Neuronen, die Hcrt-Peptide produzieren, sind auf den lateralen Hypothalamusbereich beschränkt, ihre Projektionen erstrecken sich jedoch weit über das gesamte Gehirn3. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Integrität des Hcrt-Systems für die Erregungsstabilität von entscheidender Bedeutung ist. Der Verlust von Hcrt-Neuronen bei Hunden, Mäusen und Menschen führt zu Narkolepsie mit Kataplexie. Es wird angenommen, dass diese Stabilität durch die Integration mehrerer Variablen aus lokalen hypothalamischen Verbindungen sowie Afferenzen aus Hippocampus, Septum und Amygdala erreicht wird4.

Zusätzlich zu der nachgewiesenen Rolle bei Übergängen des Erregungszustands deuten mehrere Belege darauf hin, dass das Hypocretin/Orexin-System ein wichtiges Relais bei der Verarbeitung von Gehirnbelohnungen ist5,6. Wir und andere haben gezeigt, dass der Hcrt-R-Antagonismus die Motivation zur Suche nach einer Belohnung verringert7 und die Wiederaufnahme des Kokainkonsums durch Stress blockiert8,9. Dieser Effekt ist wahrscheinlich auf einen langanhaltenden Anstieg der dopaminergen Erregbarkeit zurückzuführen, der durch die Hcrt-Freisetzung10,11,12 über die HcrtR1-Signalisierung13,14 hervorgerufen wird.

Impulsivität, oft definiert als Handeln ohne Voraussicht oder Rücksicht auf Konsequenzen, ist ein wesentliches Merkmal zahlreicher psychiatrischer Erkrankungen, einschließlich Sucht und bipolarer Störung15,16. Ein wichtiges gemeinsames Merkmal von Erregung und Sucht liegt in der Integration hervorstechender Signale, um angemessene zielgerichtete Entscheidungen zu treffen. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Aktivität von Hcrt-Neuronen mit der Exposition gegenüber Reizen sowohl positiver als auch negativer Wertigkeit korreliert17,18. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die durch diese Reize ausgelöste Hcrt-Aktivität einen Einfluss auf die Entscheidungsfindung hat. Hier haben wir die Rolle der Hcrt-Aktivität bei der Entscheidungsfindung und Handlungsimpulsivität untersucht, indem wir das Hcrt-System mithilfe von Pharmakologie und Optogenetik während einer etablierten Go/NoGo-Aufgabe moduliert haben.

Wir verwendeten Faserphotometrie, um die Aktivität von Hcrt-Neuronen in einer Go/NoGo-Aufgabe zu überwachen. Wir haben Hcrt-IRES-cre-Knockin-Mäuse18 auf die Go/NoGo-Aufgabe mit einer Genauigkeit von bis zu 70 % trainiert, einen für GCamp6f kodierenden viralen Vektor infundiert und eine optische Faser in den lateralen Hypothalamus implantiert (ergänzende Abbildung 3). Wir zeichneten die neuronale Hcrt-Aktivität während der Go/NoGo-Aufgabe auf und analysierten offline die Signalveränderung während der Übergänge zwischen den Aufgabenphasen (Precue, Go und NoGo Cues, Reward, ITI). Wie in Abb. 1A und D gezeigt, nahmen die Kalziumreaktionen tendenziell beim Übergang von Precue- zu Cue-Perioden zu, insbesondere bei Tieren, die richtig auf den Go-Cue reagierten (Zeit x Übergangsinteraktion F(1,4) = 2,69, p = 0,10). ). Die korrekten Go-Kurven unterschieden sich deutlich von den Precue-Kurven (Abb. 1D; p = 0,03). Dieses Signal steht im Gegensatz zu den geringen Aktivitätsniveaus, die während der NoGo-Cue-Periode beobachtet wurden (Abb. 1B). Tiere, die falsche Reaktionen zeigten, zeigten moderate, aber signifikante Unterschiede in den Kalziumsignalen bei Reizexposition, was mit einer Reaktion auf hervorstechende Reize übereinstimmt18. Die Kalziumsignale stiegen während der Go-Cue-Periode zunehmend an und erreichten gleichzeitig mit der Zustellung einer Belohnung Spitzenwerte (Abb. 1B) (Zeit F(1,4) = 9,27, p = 0,04). Im Gegensatz dazu blieb das Kalziumaktivitätsprofil der Hcrt-Neuronen während des NoGo-Hinweises niedrig, zeigte aber auch unmittelbar nach dem Nosestoche einen Höhepunkt. Der Übergang von der Belohnung zum Ende des Versuchs in die Zeit zwischen den Versuchsintervallen zeigte ebenfalls einen Aktivitätspeak (Abb. 1C, F) (Zeit F(1,4) = 7,88, p = 0,048), aber beides stimmte Go- und NoGo-Gruppen zeigten ähnliche Reaktionen (Zeit x Übergang F(1,4) = 0,007, p = 0,94). Bei Wildtyp-Mäusen (Hcrt-IRES-cre-) wurde kein Fluoreszenzsignal festgestellt (ergänzende Abbildung 1).

Mittleres ΔF/F von Hcrt-Neuronen 5 s vor und 5 s nach (A, D) Precue to Cue, (B, E) Cue to Reward oder (C, F) Reward to ITI-Übergängen in der Go/NoGo-Aufgabe. A–C-Zeit 0 und die vertikale gepunktete Linie bezeichnen den Übergangspunkt. Der Farbton gibt die Reaktion der Tiere bei der Go/NoGo-Aufgabe an. Der schattierte Bereich stellt das SEM dar. Die untere Reihe (D–F) zeigt das mittlere Signal während der 1 s vor und 1 s nach dem oben beschrifteten Übergang. *bezeichnet den Unterschied zwischen den Gruppen (Bonferroni-Test, p < 0,05).

Um festzustellen, ob der Höhepunkt der Hcrt-Aktivität ursächlich für eine impulsive Aktion war, verwendeten wir optogenetische Stimulation von Hcrt-Neuronen während der ersten 5 s der Go- und NoGo-Signale. Wir haben Parameter ausgewählt, die mit In-vivo-Aufzeichnungen von Hcrt-Neuronen19 bei 5 und 10 Hz übereinstimmen. Die Stimulation während des Go-Hinweises hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Anzahl der Antworten (P > 0,05) (Abb. 2A). Allerdings verringerte die Hcrt-Stimulation während des NoGo-Hinweises die Wahrscheinlichkeit korrekter NoGo-Versuche drastisch (p < 0,001 RM-ANOVA mit Bonferroni-Mehrfachvergleichen) (Abb. 2B; Zusatzfilme 1 und 2). Interessanterweise erhöhte die optogenetische Stimulation von Hcrt während der Pre-Cue-Periode auch die vorzeitigen Reaktionen bei Hcrt-cre-Tieren, jedoch nicht bei Wildtyp-Kontrollmäusen (P > 0,05, RM-ANOVA) (Abb. 2C). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Hcrt-Neuronen auf hervorstechende Signale im Zusammenhang mit einer Belohnung reagieren und die Aktivität unterdrückt wird, wenn eine Verhaltenshemmung erforderlich ist.

Die Auswirkungen einer optogenetischen 5- oder 10-Hz-Stimulation von Hcrt-Neuronen auf das Go/NoGo-Verhalten. Eine Hcrt-Stimulation hat keinen Einfluss auf die Wahrscheinlichkeit einer korrekten Go-Reaktion, verringert jedoch (B) die Wahrscheinlichkeit einer korrekten NoGo-Reaktion und (C) erhöht die Precue-Reaktionsrate. Bei Hcrt-cre-Kontrollen (grau) sind keine Auswirkungen zu beobachten. Die Farbe gibt den Genotyp und die Schattierung die Laserfrequenz an. * bezeichnet den Unterschied zu Kontrollversuchen ohne Laser innerhalb desselben Genotyps (Bonferroni-Test, p < 0,05) und † bezeichnet den Unterschied zu Hcrt-cre-Kontrollen bei dieser bestimmten Laserfrequenz. Boxplots zeigen Durchschnittswerte und Standardabweichungen an. Whisker umfassen Maxima- und Minimawerte.

Hcrt übt seine Wirkung auf zwei GPCRS aus, die unterschiedlich an Hcrt1 und Hcrt2 binden. Studien an Knockout-Tieren zeigen, dass sowohl die HcrtR1- als auch die HcrtR2-Signalübertragung die Schlaf-Wach-Stabilität beeinflussen20, wohingegen HcrtR1 die Auswirkungen auf die Belohnungsfunktion des Gehirns moduliert21. Wir verwendeten daher einen selektiven HcrtR1-Antagonisten, um zu testen, ob die HcrtR1-Signalübertragung für die Wirkung von Hcrt auf die Impulsivität notwendig ist.

Um die Wirkung von HcrtR1-Antagonisten zu kalibrieren, haben wir die Reaktionen der Tiere auf die Go/NoGo-Aufgabe nach Injektionen unterschiedlicher Dosen Amphetamin (Abb. 3A, D, G) ausgewertet (1 und 2,5 mg wurden 10 Minuten vor dem Test verabreicht, a Psychostimulans, von dem bekannt ist, dass es impulsive Entscheidungen steigert22 oder Atomoxetin (Abb. 3B, E, H), ein noradrenerger Wiederaufnahmehemmer, der die Leistung bei der Go/NoGo-Aufgabe verbessert23. Tatsächlich verringerte die Behandlung mit Amphetamin dosisabhängig die NoGo-Wahrscheinlichkeit (P < 0,05 RM- ANOVA) (Abb. 3D), wohingegen Atomoxetin die Leistung der Mäuse leicht verbesserte (P < 0,05 RM-ANOVA) (Abb. 3B, H). Ähnlich wie Atomoxetin erhöhte der selektive HcrtR1-Antagonist dosisabhängig die No Go-Wahrscheinlichkeit und verringerte die Pre-Cue-Reaktionsrate (P < 0,05 RM-ANOVA) (Abb. 3F, I).

Amphetamin verringert die korrekte NoGo-Reaktionsrate (D) und erhöht die PreCue-Reaktionsrate (G), verändert jedoch nicht die korrekte Go-Reaktionsrate (A). Im Gegensatz dazu erhöht Atomoxetin die korrekte Go-Reaktionsrate (B) und verringert die PreCue-Reaktionsrate (H), verändert jedoch nicht die korrekte NoGo-Reaktionsrate (E). Selektiver HcrtR1-Antagonismus verringert die korrekte Go-Antwortrate (C) und PreCue-Antwortrate (I) und erhöht die korrekte NoGo-Antwortrate (F). Vehikeldaten werden zwischen Amphetamin- und Atomoxetingruppen geteilt (verabreichte IP), wohingegen HcrtR1-Antagonistendaten mit Vehikeln verglichen werden, die in derselben Modalität (orale Sondenernährung) verabreicht wurden. *bezeichnet den Unterschied zwischen der Fahrzeugbehandlung (Bonferroni-Test, p < 0,05). Boxplots zeigen Durchschnittswerte und Standardabweichungen an. Whisker umfassen Maxima- und Minimawerte.

Anschließend verglichen wir die operanten Reaktionen in einem Go/NoGo-Paradigma nach optogenetischer Hcrt-Stimulation und systemischer pharmakologischer Behandlung mit Amphetamin (Abb. 4A, D, G), Atomoxetin (Abb. 4B, E, H) oder einem selektiven HcrtR1-Antagonisten (Abb . 4C, F, I). Die Wahrscheinlichkeit vorzeitiger Reaktionen während der PreCue-Periode wurde durch die systemische Verabreichung von Amphetamin erhöht, ähnlich wie bei der Hcrt-Neuronenstimulation (Abb. 4G) (P < 0,05 Haupteffekte der Behandlung, Genotyp in der Zwei-Wege-RM-ANOVA). Im Gegensatz dazu konnte durch die Behandlung mit Atomoxetin, einem noradrenergen Aufnahmehemmer, der bekanntermaßen die Aufmerksamkeit erhöht und die Impulsivität verringert24, die Wirkung der Hcrt-Photostimulation teilweise wiederhergestellt werden (Abb. 4E, H) (P < 0,05). Haupteffekte und Wechselwirkung von Behandlung und Genotyp bei bidirektionalem RM -ANOVA). Der HcrtR1-Antagonist hat den durch die Hcrt-Stimulation hervorgerufenen Anstieg vorzeitiger Reaktionen vollständig wiederhergestellt (Abb. 4F) (P < 0,05 Haupteffekte und Wechselwirkung von Behandlung und Genotyp in der Zwei-Wege-RM-ANOVA).

Die Auswirkungen einer 10-Hz-Hcrt-Stimulation bei gleichzeitiger Verabreichung von Amphetamin (A, D, G), Atomoxetin (B, E, H) oder HcrtR1-Antagonisten (C, F, I) in verschiedenen Dosierungen auf die korrekte Go-Reaktionsrate (A, B, C, während der ersten 5 s des Go-Cue-Zeitraums abgegebene Stimulation), korrekte NoGo-Reaktionsrate (D, E, F, während der ersten 5 s des NoGo-Cue-Zeitraums abgegebene Stimulation) und PreCue-Reaktionsrate (G, H, I, Stimulation, die während der letzten 5 s der PreCue-Periode abgegeben wurde, werden angezeigt. Die Farbe gibt den Genotyp an (lila für hcre-cre+ und grau für die Kontrollen) und die Schattierung gibt die Dosierung an (dunkler für höhere Dosierungen). Vehikeldaten werden zwischen Amphetamin- und Atomoxetingruppen geteilt (verabreichte IP), wohingegen HcrtR1-Antagonistendaten mit Vehikeln verglichen werden, die in derselben Modalität (orale Sondenernährung) verabreicht wurden. *bezeichnet den Unterschied zum Vehikel innerhalb desselben Genotyps (Bonferroni-Test, p < 0,05); † bezeichnet den Unterschied zu Hcrt-cre-Kontrollen bei dieser bestimmten Dosierung (Bonferroni-Test, p < 0,05).

Impulsivität, die zu einer Beeinträchtigung der Entscheidungsfindung führt, ist mit vielen psychiatrischen Störungen und Verhaltensstörungen verbunden, wie z. B. Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung, Ess- und Substanzmissbrauchsstörungen25,26,27. Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen Koffeinkonsum, Schlafverlust, Risikoverhalten und Impulsivität festgestellt28,29, obwohl die neuronalen Mechanismen solcher Beziehungen unbekannt sind. Das Yerkes-Dodson-Gesetz besagt, dass es bis zu einem bestimmten Punkt einen Zusammenhang zwischen physiologischer Erregung und Leistung gibt, bei dem ein Übermaß an Erregung zu schlechter Leistung führt. Tatsächlich gibt es Hinweise darauf, dass Hypoarousal bei narkoleptischen Patienten mit Hcrt-Mangel zu Aufmerksamkeitsdefiziten führt30. Hier haben wir eine Go/NoGo-Aufgabe verwendet, um die Leistung und das motorische Impulsivitätsverhalten bei Mäusen zu bewerten und zu testen, ob die durch das Neuropeptid Hcrt gesteuerte Erregung dem Yerkes-Dodson-Gesetz folgt. Wir zeigen, dass Hyperarousal, das durch optogenetische Stimulation von Hcrt-Neuronen bei Frequenzen induziert wird, die mit ihrem phasischen Aktivitätsprofil übereinstimmen31,32, auch die Aufmerksamkeitsleistung verringert.

Die durch die Hcrt-Aktivität verursachte erhöhte Impulsivität steht im Einklang mit anderen Berichten, die eine verminderte Impulsivität für Kokain bei der Behandlung mit Suvorexant, einem dualen HcrtR-Antagonisten, belegen33. Hcrt-Neuronen scheinen durch eine Vielzahl hervorstechender Reize sowohl positiver als auch negativer Wertigkeit aktiviert zu werden17,18. Daher kann die Hcrt-Aktivität als Alarm-/Notfallsignal interpretiert werden, das schnell monoaminerge Erregungskreise aktiviert. Mit cFos haben Freeman et al. 34 zeigten, dass die Aktivierung der medialen, aber nicht der lateralen hypothalamischen Hcrt-Neuronen mit einer höheren Genauigkeit bei der Go/NoGo-Aufgabe korrelierte. Die schlechte zeitliche Auflösung der cFos-Immunreaktivität (60 Minuten nach der Go/NoGo-Sitzung) verhindert direkte Vergleiche mit unseren Studien. Eine Einschränkung unserer Ergebnisse besteht darin, dass die genaue Platzierung der Kanüle aufgrund der schlechten Gewebequalität nicht anatomisch überprüft werden konnte. Wir haben jedoch vor den optogenetischen Experimenten die genaue Platzierung getestet, indem wir die Schlaf-Wach-Übergänge nach einer 10-Hz-Stimulation überwacht haben. Diese Methode erwies sich in unserer vorherigen Arbeit als äußerst zuverlässig17. Wir haben auch die Genauigkeit der Injektionsbedingungen und die eutopische Expression der Transgene in neuen Tieren überprüft (ergänzende Abbildungen 2 und 3).

Welcher Mechanismus treibt die von Hcrt-Neuronen hervorgerufene Impulsivität an? Die neuronalen Schaltkreise, die Go/NoGo zugrunde liegen, wurden sowohl mit der funktionellen als auch strukturellen Integrität von Gehirnsystemen in Verbindung gebracht, von denen bekannt ist, dass sie bei der Abhängigkeit von Stimulanzien bei Menschen35,36 und Nagetieren26,27 beeinträchtigt sind. Die Fähigkeit, Handlungen zu hemmen, nachdem sich eine Gewohnheit gebildet hat, wurde klassischerweise mit neuronalen Schleifen zwischen der ventralen Tegmentalregion (VTA) und der Schale des Nucleus accumbens (NAcc) sowie mit kortikostriatalen Schleifen in Verbindung gebracht. Wie diese Strukturen durch Erregung und Aufmerksamkeit moduliert werden, ist jedoch noch wenig verstanden. Als Hauptsubstrat der Warteimpulsivität wurden Wechselwirkungen zwischen der NAcc-Hülle und dem VTA vorgeschlagen, wobei VTA-Neuronen zu GABAergen Zellen in der NAcc-Hülle projizieren, die wiederum zu GABA-Interneuronen im VTA projizieren. Eine impulsive vorzeitige Reaktion ist mit einer verminderten Dopaminausschüttung im Kern und einer erhöhten Dopaminausschüttung in der Schalen-Subregion verbunden37. Wesentliche Beweise zeigen wechselseitige Verbindungen zwischen Hcrt- und D2-Rezeptor-haltigen Neuronen in der NAcc-Hülle und dem VTA. Hcrt1 erhöht das Feuern lateraler und medialer NAcc-Shell-Neuronen38. Kürzlich haben Gonzalez et al. 39, zeigten, dass Hcrt-Neuronen ihre Aktivität während der Annäherung an Nahrung erhöhten und diese Aktivität zu Beginn des Konsumverhaltens auf den Ausgangswert abfiel, was durch wechselseitige Interaktionen zwischen der Hülle der NAcc- und Hcrt-Neuronen vermittelt wurde. Die nach der Behandlung mit einem Hcrt-R1-Antagonisten beobachteten verringerten korrekten Go-Reaktionen (Abb. 2C) sind aufgrund erhöhter Schläfrigkeit unwahrscheinlich20, da Hcrt-R1-Knockout-Mäuse einen milden Schlafphänotyp aufweisen; Stattdessen deuten diese Mäuse darauf hin, dass HcrtR1 für die nahrungsmittelverstärkte Reaktion, Motivation oder beides notwendig ist21. Blomeley et al. 40 beschrieben einen direkten Hcrt→D2-Erregungskreislauf und zeigten, dass die D2-Zellaktivität für die Hcrt-abhängige angeborene Risikovermeidung bei Mäusen notwendig ist40. Dynorphin, das von Hcrt+ im LH gemeinsam freigesetzt wird, hemmt die meisten Dopamin-Neuronen, die in die mediale NAcc-Hülle und die basolaterale Amygdala projizieren, reduziert jedoch das Feuern nur in einem kleinen Teil derjenigen, die in die laterale NAcc-Hülle projizieren. Es wurde vermutet, dass die Aktivierung von Kappa-Opioidrezeptoren die Impulsivität im 5CSRRT41 erhöht. Unsere optogenetische Stimulation von Hcrt-Neuronen könnte die Dynorphin-Freisetzung erhöht haben42,43. Daher ist es denkbar, dass Änderungen im E/I-Verhältnis, die durch die Hcrt-Freisetzung in der NAcc-Hülle hervorgerufen werden, vorzeitige Reaktionen hervorrufen könnten, entweder durch Bindung an Hcrt-Rezeptoren auf D2-Neuronen oder NPY + Interneuronen. Es ist bemerkenswert, dass die neuromodulatorische Wirkung von Hcrt im NAcc spezifisch zu sein scheint, da die chemogenetische Aktivierung von VTA-Neuronen die Impulsivität nicht beeinflusst44,45. Die Hcrt-Aktivität kann auch das E/I-Gleichgewicht der hypothalamischen Ausgänge verschieben: Die Erregung des LH(GAD65)-Neurons induziert eine erhöhte Bewegungsaktivität, während die Hemmung der natürlichen Aktivität des LH(GAD65)-Neurons die willkürliche Fortbewegung unterdrückt46. Der Hcrt → LH(GAD65)-Schaltkreis kann daher dabei helfen, den Antrieb zum Laufen zu erzeugen, was sich im Go/NoGo-Assay in verstärkten vorzeitigen Reaktionen widerspiegelt.

Zusätzlich zum kanonischen VTA→NAcc-Shell-Schaltkreis aktiviert die optogenetische Hcrt-Stimulation den Locus coeruleus (LC)47, eine Struktur, die auch an impulsivem Verhalten beteiligt ist, das durch die Noradrenalinfreisetzung im präfrontalen Kortex (PFC)48 oder im NAcc49 vermittelt wird. Die Freisetzung von Noradrenalin (NE) in der NAcc-Hülle spielt eine wichtige Rolle bei den Auswirkungen von Atomoxetin auf die Impulsivität, während NE im PFC die Auswirkungen von Amphetamin auf das Impulsverhalten abschwächt. Da die optogenetische Hcrt-Stimulation die Wirkung von Amphetamin auf die Impulsivität nicht veränderte, scheint NE die Hcrt-Wirkung im NAcc zu modulieren.

Mithilfe der Faserphotometrie haben wir gezeigt, dass die Hcrt-Neuronenaktivität im lateralen Hypothalamus zum Zeitpunkt der Zustellung einer Belohnung in Go-Versuchen ihren Höhepunkt erreicht, was mit der berichteten Erhöhung der Feuerrate von 74 % der Neuronen in globalen Aufzeichnungen einer Auswahlaufgabe übereinstimmt50. Aktuelle Studien von Burdakov et al. 46 und unser eigenes Labor17 deuten darauf hin, dass Hcrt-Neuronen empfindlich auf mehrere hervorstechende Reize reagieren und die erhöhte Ca2+-Konzentration während der Go-Sitzung diese Ausprägung widerspiegeln könnte (Abb. 1). Ähnliche Photometrieprofile wurden bei der Aufzeichnung der Reaktionen von TH + noradrenergen Neuronen im Locus coeruleus beobachtet, einer Gehirnstruktur, die entscheidend an der Aufmerksamkeit beteiligt ist. Frühere Arbeiten aus unserem Labor haben gezeigt, dass Hcrt-Neuronen dicht zum LC projizieren und dass die optogenetische Blockierung der neuronalen Aktivität von LC Hcrt-induzierte Übergänge vom Schlaf zum Wachzustand verhindert47. Die Photometrieprofile von Hcrt- und LC-Neuronen waren auch ähnlich, wenn sie während korrekter NoGo-Versuche und während vorzeitiger Reaktionen in NoGo-Sitzungen aufgezeichnet wurden. Die HcrtLC-Verbindung wird wahrscheinlich über HcrtR1-Rezeptoren signalisiert, basierend auf ihrem berichteten Expressionsmuster im LC51,52. Dementsprechend konnten HcrtR1-Antagonisten die durch Amphetamin hervorgerufenen vorzeitigen Reaktionen reduzieren.

ADHS ist durch ein entwicklungsbedingt unangemessenes Maß an Unaufmerksamkeit, Impulsivität und/oder Hyperaktivität gekennzeichnet, und Atomoxetin und andere Stimulanzien wurden zur Behandlung von Erwachsenen mit dieser Störung eingesetzt53. Tatsächlich zeigen wir hier, dass Atomoxetin, ein noradrenerger Aufnahmehemmer, normale Reaktionen nach Impulsivität, die durch optogenetische Hcrt-Stimulation hervorgerufen wird, teilweise wiederherstellt. Ein selektiver Hcrt-R1-Antagonist schien die Wahrscheinlichkeit eines inhibitorischen Verhaltens im Impulsivitätstest wirksamer zu beseitigen, was auf eine mögliche klinische Anwendung bei der Behandlung psychiatrischer Störungen mit maladaptiver Impulsivität schließen lässt.

Hier haben wir einen kausalen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von Hcrt-Neuronen und dem Warten und Stoppen der Impulsivität nachgewiesen. Die optogenetische Stimulation von Hcrt-Neuronen verstärkte vorzeitige Reaktionen in NoGo-Versuchen, während ein selektiver HcrtR1-Antagonist die Wirkung von Amphetamin auf eine Go/NoGo-Aufgabe reduzierte. Dieser Effekt wird wahrscheinlich durch dopaminerge und noradrenerge Mechanismen im Striatum und im PFC vermittelt. Die Robustheit und Spezifität von HcrtR1-Antagonisten bei dieser Aufgabe macht sie zu hervorragenden pharmakologischen Instrumenten zur Behandlung von ADHS und anderen mit Impulsivität verbundenen Störungen.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des US National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Verwaltungsgremium der Stanford University für Labortierpflege (Protokoll-ID Nr. 18787) genehmigt.

Die Tiere erhielten jedes Medikament/jede Dosis in zufälliger Reihenfolge, um sich vor Reihenfolgeeffekten zu schützen, wobei zwischen den Behandlungstagen mindestens 3 Tage lagen, um eine ausreichende Auswaschung zu ermöglichen. Atomoxetinhydrochlorid wurde von Sigma (Y0001586) bezogen und in 0,9 % NaCl (Kochsalzlösung) gelöst, das 30 Minuten vor Beginn des Go/NoGo per intraperitonealer Injektion in einer Dosis von entweder 5 mg/kg oder 10 mg/kg verabreicht wurde prüfen. D-Amphetaminhemisulfat wurde von Sigma (A5880) bezogen und in 0,9 % NaCl (Kochsalzlösung) gelöst, das 10 Minuten vor Beginn des Go/ NoGo-Test22,54). Zusätzlich wurde ein HcrtR1-Antagonist von Boehringer Ingelheim (Patent WO2017/178339) erhalten und in 0,5 % Hydroxyethylcellulose (Sigma, 525944) und 0,015 % Tween 80 (Sigma, P1754) in Wasser gelöst, das über eine orale Sonde in einer Dosis von verabreicht wurde entweder 2,5 mg/kg, 7,5 mg/kg oder 12,5 mg/kg. Zusätzlich zu den 7 Medikamenten-/Dosisgruppen wurden zwei Kontrollgruppen eingeschlossen, in denen Mäuse entweder 10 Minuten vor Beginn des Go/NoGo-Tests eine intraperitoneale Injektion von Kochsalzlösung erhielten oder die Vehikellösung erhielten, die zur oralen Verabreichung der HcrtR1-Verbindung verwendet wurde Sondenernährung 60 Minuten vor Beginn des Go/NoGo-Tests.

Männliche Hcrt-IRES-Cre-Knock-In-Heterozygotenmäuse (Hcrt-cre +), die auf C57BL6J-Hintergrund (N9) rückgekreuzt waren, wurden im Haus gezüchtet, wobei Wildtyp-Wurfgeschwister (Hcrt-cre-) als Kontrollen dienten. Die Mäuse wurden in Gruppen von bis zu fünf Mäusen in Plexiglaskammern mit stabiler Temperatur (22 ± 1 °C), Luftfeuchtigkeit (40–60 %) und Lichtverhältnissen (9:00–21:00 Uhr dunkel; 9:00 Uhr) gehalten. 00:00–09:00 Uhr Licht). Zu Beginn des Trainings wogen die Mäuse etwa 27 g. Während des Trainings wurden die Mäuse auf ein Wasserrestriktionsparadigma umgestellt, bei dem ihnen am Ende ihrer aktiven Periode zwei bis vier Stunden lang Zugang zu Wasser gewährt wurde. Alle Schulungen, Aufzeichnungen und Manipulationen fanden während der Dunkelperiode statt.

Mäuse wurden mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) anästhesiert und auf einen stereotaktischen Tierrahmen (David Kopf Instruments) montiert und erhielten Injektionen von 0,3 μl AAV-DJ-EF1α-DIO-hChR2( H134R)-eYFP-Virus (2,5 × 1012 Genomkopien pro ml, Stanford Virus Core) zum rechten oder linken lateralen Hypothalamus (LH) (AP: − 1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: −5,15 mm) mit einem 5 μl Hamilton-Mikrospritze. Für optogenetische Stimulationen wurde eine Glasfaser (200 μm Durchmesser, Doric Lenses, Franquet, Québec, Kanada) mit der Spitze direkt über der Injektionsstelle implantiert. Für die Faserphotometrie wurden 0,3 μl AAV-Vektoren, die Gene tragen, die für GCaMP6f kodieren (AAV-DJ-EF1α-DIO-GCaMP6f, 1,1 × 1013 Genomkopien pro ml, Stanford Virus Core), rechts oder links links (AP: −1,35 mm, ML: ± 0,95 mm, DV: –5,15 mm) mit einer 5 μl Hamilton-Mikrospritze und eine Glasfaser (400 μm Durchmesser, 0,48 NA, Doric Lenses) wurde mit der Spitze an der Injektionsstelle für die spätere GCaMP6f-Signalerfassung implantiert . Hcrt-cre+- und Hcrt-cre- (Kontroll-)Mäuse erhielten eine identische Virusbehandlung.

Den Tieren wurde zunächst beigebracht, zu lernen, wo die Belohnung erfolgt, indem sie nach einem Zufallsintervall von 60 Sekunden trainiert wurden, bis sie zuverlässig die Belohnungsöffnung für Nasenstiche untersuchten (>200 Nasenstiche pro Sitzung) und während des Belohnungszeitraums zuverlässig Nasenstiche machten ( bis ~80 % der Belohnungszeiträume mindestens einen Nasenstich zeigten). Anschließend wurden die Mäuse in einer Sitzung von entweder 40 Minuten oder 60 Versuchen (je nachdem, was zuerst eintritt) mit nur Go-Cue-Versuchen auf dem „Go Cue“ trainiert. Sobald die Mäuse zuverlässig auf den Go-Cue reagierten (>70 % genaue Reaktion auf den Go-Cue an drei aufeinanderfolgenden Trainingstagen), wurde der „NoGo-Cue“ eingeführt, sodass die 40-minütige/60-Probesitzung eine zufällige Verteilung von 50 % der Go-Versuche und war 50 % NoGo-Tests. Sobald die Mäuse zuverlässig genau auf Go- und NoGo-Hinweise reagierten (>70 % korrekte Antworten auf Hinweise an drei aufeinanderfolgenden Trainingstagen), galten die Mäuse als bereit für den Test. Die zuverlässige Genauigkeit blieb zwischen den Testtagen mit regelmäßigem Training (mindestens 5 Tage pro Woche) erhalten – Mäuse wurden nur getestet, wenn ihre letzte Trainingseinheit eine Genauigkeit von >70 % sowohl bei Go- als auch bei NoGo-Hinweisen aufwies (Abb. 5).

Nach einer Precue-Periode variabler Länge (Dauer 9–24 s, Käfiglicht an), werden Go- und NoGo-Perioden (Dauer 10 s oder bis zum Nosestoche, Käfiglicht an) dem Tier über einen deutlichen akustischen Hinweis signalisiert. ITI steht für Inter-Trial-Intervall (Dauer 10 s, Käfiglicht aus). Vorzeitige Antworten während des Pre-Cue-Zeitraums und falsche Antworten während des Cue-Zeitraums lösen den Übergang zum ITI aus, ebenso wie der Abschluss des Belohnungszeitraums (Dauer 3 s, Käfiglicht an). Schattierte Kästchen weisen auf falsche Antworten hin.

Die folgenden Parameter wurden pro Sitzung berechnet: Treffer: Die Häufigkeit, mit der ein Tier während der Cue-Periode eines Go-Versuchs in einer bestimmten Sitzung einen Nasenstich ausführt; Fehlalarme: die Anzahl der NoGo-Versuche, bei denen das Tier während der NoGo-Hinweisperiode einen Nasenstich gemacht hat; PreCue-Reaktionsrate: Die Gesamtzahl der Antworten, die während aller Pre-Cue-Zeiträume erfolgten, wird durch die Gesamtdauer aller Pre-Cue-Zeiträume geteilt. Wenn während der Cue-Präsentation kein Poke aufgetreten ist, wird der Wert auf die maximale Latenz (maximale Zeit der Cue-Präsentation) gesetzt.

Für eine Faserphotometrie-Aufzeichnung wurden Hcrt-cre+- und Hcrt-cre--Mäuse an ein flexibles Aufzeichnungskabel angeschlossen und in der Operationskammer platziert. Dort wurde ihr GCaMP6f-Signal 12 Minuten lang aufgezeichnet, 1 Minute Basisaufzeichnung, während die Maus im Operantenkäfig ruhte und keine Aufgabe ausgeführt wurde, und anschließend 10 Minuten Go/NoGo-Versuche (Verhältnis von Go zu NoGo-Versuchen 50:50). , gefolgt von einer zusätzlichen Minute der Aufzeichnung nach der Sitzung. Die Aufnahmen wurden mit der zuvor beschriebenen Ausrüstung erfasst55,56. Kurz gesagt wurde 470-nm-Anregungslicht (M470F3, Thorlabs, NJ, USA) mit einem benutzerdefinierten Matlab-Programm (MathWorks, Natick, MA, USA) und einem multifunktionalen Datenerfassungsgerät (NI USB-6259, National Instruments, USA) bei 211 Hz sinusförmig moduliert. Austin, TX, USA). Das Anregungslicht passierte einen GFP-Anregungsfilter (MF469-35, Thorlabs) und wurde von einem dichroitischen Spiegel (MD498, Thorlabs) über ein Faserkollimationspaket (F240FC) in ein Patchkabel mit geringer Fluoreszenz (400 µm, 0,48 NA; Doric Lenses) reflektiert -A, Thorlabs). Das Patchkabel wurde über eine Zirkonoxidhülse (SLEEVE_ZR_2.50, Doric Lenses) mit der implantierten Glasfaser des Tieres verbunden. Die GCaMP6f-Fluoreszenz wurde durch das Patchkabel gesammelt und durch einen GFP-Emissionsfilter (MF525-39, Thorlabs) geleitet und auf einen Fotodetektor (LA1540-A, Thorlabs; Modell 2151, Newport, Irvine, CA, USA) fokussiert. Das Signal wurde dann an einen Lock-In-Verstärker (30-ms-Zeitkonstante, Modell SR830, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA) gesendet, auf 211 Hz synchronisiert und dann bei 1 KHz mit einem benutzerdefinierten Matlab-Skript und Multifunktionsdaten gesammelt Erfassungsgerät (National Instruments). GCaMP6f-Signale wurden über von der Operantenkammer gesendete TTL-Impulse an das Verhalten in der Operantenkammer angepasst und über ein benutzerdefiniertes Matlab-Skript in einem parallelen Datenstrom aufgezeichnet. Um die Änderung der GCaMP6f-Signale zu quantifizieren, wurden die Werte vor Zustandsübergängen als Basislinie gemittelt und die Flächengröße (ΔF/F-Integral) zwischen der Basislinie und der GCaMP6f-Signalspur wurde für jede einzelne Maus bestimmt und gemittelt.

Um die Wirkung der Stimulierung von Hcrt-Neuronen bei der Go/NoGo-Aufgabe zu untersuchen, wurden Hcrt-cre+- und Hcrt-cre--Mäuse über ein Glasfaser-Patchkabel mit einem Laser verbunden. Die Lichtintensität wurde an der Spitze mit einem Lichtmessgerät (Thorlabs) auf 10 mW kalibriert. Anschließend wurde das Glasfaser-Patchkabel (MFP_200/240/900-0,22_3,0 m_FC-MF2,5, Doric-Linsen) über eine Zirkonoxidhülse (SLEEVE_ZR_2,50, Doric-Linsen) mit dem Glasfaserimplantat verbunden. Um die Faserplatzierung zu überprüfen, wurde bestätigt, dass die Tiere innerhalb von 20 s nach der Stimulation (5 s bei 5 Hz, 10 ms Impulsbreite, 10 mW) aufwachten (eine Bewegung einleiteten), die während eines anhaltenden (30+ Sekunden) schlafähnlichen Verhaltens verabreicht wurde, wie an anderer Stelle berichtet57 ,58. Da die Gewebeintegrität in nicht fixiertem Gewebe beeinträchtigt war, wurde die anatomische Lokalisierung der Kanüle post mortem in einer separaten Tiergruppe überprüft (siehe ergänzende Abbildung 2). Nach Gewöhnung an das Go/NoGo-Gerät mit faseroptischem Anschluss wurde während der Go/NoGo-Versuche an verschiedenen Stellen eine optogenetische Stimulation mit unterschiedlichen Frequenzen durchgeführt (Lichtintensität an der Faserspitze: 10 mW, Lichtpulsbreite: 15 ms; 5 und 10 Hz). Stimulation für 5 s durchgeführt). Der Zeitpunkt der Laserstimulation wurde zufällig auf vier Versuchsbedingungen verteilt: (1) keine Laserstimulation; (2) Laserstimulation für die letzten 5 s der PreCue-Periode; (3) Laserstimulation für die ersten 5 s der Go-Cue-Periode; und (4) Laserstimulation für die ersten 5 s der NoGo-Cue-Periode. Die Parameter für die optogenetische Stimulation wurden auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Validierungen der optogenetischen Hcrt-Stimulation aus unserem Labor ausgewählt18,56.

Zur Kolokalisierung der ChR2/GCaMP-Expression und der Hypocretin-Immunreaktivität perfundierten wir Mäuse transkardial mit Phosphatpuffer, gefolgt von gepuffertem 4 % Paraformaldehyd (pH 7,4). Die extrahierten Gehirne wurden dann 2 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd nachfixiert, bevor sie zum Kryoschutz 48 Stunden lang in 30 % Saccharoselösung gelegt wurden. Anschließend wurden die Gehirne auf einem Leica-Kryostat bei 30 µm geschnitten und bis zur Färbung in Phosphatpuffer gelagert. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei 36 °C in 5 % Rinderserumalbumin/0,5 % Triton-Lösung blockiert. Anschließend wurden die Schnitte in primärem Antikörper gegen Hypocretin-A (Abcam ab6214) in einer Verdünnung von 1:250 in 3 % BSA/0,3 % Triton inkubiert Lösung über Nacht bei 4 °C. Die Schnitte wurden dann in PBS gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit AlexaFlour594 bei einer 1:1000-Verdünnung in 3 % BSA/0,3 % TritonX100-Lösung bei 36 °C für 1,5–2 Stunden. Die Scheiben wurden dann in PBS gewaschen und dann mit DAPI montiert.

Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism 8.4.1 durchgeführt. Die Daten der Faserphotometrie wurden durch Varianzanalyse mit wiederholten Messungen (RM-ANOVA) analysiert, wobei Übergangstyp und -zeit (vor vs. nach dem Übergang) als statistische Faktoren verwendet wurden. Aufgrund ungleicher Stichprobengrößen bei den Versuchsantworten wurden die Faserphotometriedaten vom Precue-to-Cue-Übergang mithilfe eines Mixed-Effects-Modells analysiert. Die Auswirkung der optogenetischen Hcrt-Stimulationsfrequenzen auf das Verhalten wurde mithilfe von RM-ANOVA mit Stimulationsfrequenz und Genotyp als statistischen Faktoren bewertet. In ähnlicher Weise wurde die Auswirkung einer pharmakologischen Behandlung auf das Verhalten mithilfe der RM-ANOVA mit Genotyp und Behandlung als Faktoren analysiert. Bonferronis Mehrfachvergleichstests wurden nachträglich durchgeführt, um spezifische Gruppenunterschiede zu untersuchen (Ergänzungsdaten 1). Datenquelle für Abb. 2–4 finden Sie in den Zusatzdaten 2.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die im Rahmen der aktuellen Studie generierten und analysierten Datensätze sind im Stanford Digital Repository [https://purl.stanford.edu/sf095mv6553] verfügbar. https://doi.org/10.25740/sf095mv6553].

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von Boehringer Ingelheim und NIH (R01HL150566, R01MH116470, R01MH102638) finanziert. LdLKJJ ist Empfänger eines NRSA-Postdoktorandenstipendiums (F32HD095597). SMT wurde durch ein Philip Wrightson Postdoctoral Fellowship unterstützt.

Susan M. Tyree

Derzeitige Adresse: Atlantia Clinical Trials, Cork, Irland

Kimberly J. Jennings

Aktuelle Adresse: University of Texas, Austin, TX, USA

Abteilung für Psychiatrie und Verhaltenswissenschaften, Stanford School of Medicine, Stanford, CA, USA

Susan M. Tyree, Kimberly J. Jennings, Oscar C. Gonzalez, Shi-bin Li und Luis de Lecea

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG, Biberach, Germany

Janet R. Nicholson & Moritz von Heimendahl

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JRN, MvH und LdL haben diese Arbeit konzipiert. SMT führte alle Verhaltensexperimente, Kalziumaufzeichnungen und Optogenetik durch und analysierte die Daten. KJJ führte Kalziumaufzeichnungen und -analysen durch. OCG und S.-BL überprüften die anatomische Lage der Kanüle und führten eine Immunhistochemie durch. JRN, MvH und LdL überwachten die Arbeiten. LdL hat das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Luis de Lecea.

JRN und MvH erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: Sie sind Vollzeitmitarbeiter von Boehringer Ingelheim. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Karli Montague-Cardoso und George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tyree, SM, Jennings, KJ, Gonzalez, OC et al. Optogenetische und pharmakologische Interventionen verbinden Hypocretin-Neuronen mit der Impulsivität bei Mäusen. Commun Biol 6, 74 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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Eingegangen: 26. Februar 2021

Angenommen: 03. Januar 2023

Veröffentlicht: 19. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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